Интраоперационная флуоресценция сосудов в структуре глиобластом головного мозга и их гистологическая характеристика

Список сокращений:

5-AЛК — 5-аминолевулиновая кислота

5-ALA (Aminolevulinic acid) — 5-аминолевуленовая кислота

ASL — бесконтрастная магнитно-резонансная перфузия

CBF (cerebral blood flow) — церебральный мозговой кровоток

GFAP (Glial fibrillary acidic protein) — глиальный фибриллярный кислый протеин

IDH1 (Isocitrate dehydrogenase 1) — изоцитрат-дегидрогеназа 1

IDH2 (Isocitrate dehydrogenase 2) — изоцитрат-дегидрогеназа 2

MGMT — 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза

WHO (World Health Organization) — Всемирная организация здравоохранения

МРТ — магнитно-резонансная томография

ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

Флуоресцентная диагностика получила широкое применение в хирургии злокачественных глиом, поскольку быстро пролиферирующие клетки этих опухолей избирательно аккумулируют 5-аминолевуленовую кислоту (5-AЛК), которая трансформируется в протопорфирин IX, обеспечивающий флуоресцентный эффект под влиянием облучения определенной длины волны [1—3]. В последние годы получены данные о высокой чувствительности этого метода в хирургии менингиом [4—6] и в меньшей степени метастазов, глиом низкой степени злокачественности и некоторых опухолей другой гистологической природы [7—10]. cчитается доказанным, что интенсивность флуоресценции опухолей мозга зависит от гистологического типа, пролиферативного индекса, плотности опухолевых клеток и некоторых других факторов [11]. С помощью метода бесконтрастной магнитно-резонансной перфузии (ASL) показано, что уровень объемного кровотока в глиальных опухолях коррелирует со степенью их злокачественности и интраоперационной флуоресценции при использовании 5-АЛК [12]. Кроме того, известно, что определенной способностью аккумулировать флуоресцирующий агент обладают эпендима и стенки желудочков, хориоидное сплетение, а также мягкая мозговая оболочка, в то время как кровь, сосуды мозга, интактная ткань мозга и твердая мозговая оболочка не накапливают флуоресцирующий агент [1, 11, 13, 14]. Вместе с тем считается, что инфильтративный рост злокачественных глиом осуществляется вдоль волокон белого вещества, эпендимы желудочков, периваскулярных пространств, являясь причиной дистантных метастазов и послеоперационных рецидивов [8]. Факт флуоресценции корковых сосудов в ложе удаленной конвекситальной менингиомы (Grade I) документирован нами в недавней публикации, однако риск нарушения кровотока в коре не позволил выполнить биопсию и гистологическое исследование флуоресцирующего сосуда [6]. Это наблюдение послужило основанием для более детального исследования феномена флуоресценции не только опухолевой ткани, но и сосудов в строме опухоли и перифокальной зоне при удалении глиальных опухолей. На основании анализа литературы и собственных наблюдений мы высказали гипотезу о том, что флуоресценция сосудов в структуре опухолей мозга может указывать на их инфильтрацию опухолевыми клетками как на потенциальный путь их диссеминации и фактор продолженного роста опухоли после операции и адъювантной терапии.

Цель исследования — выявление флуоресцирующих сосудов, расположенных вблизи глиом головного мозга, с гистологическим описанием их структуры, взаимоотношения с опухолью и возможной инвазией стенок опухолевыми клетками.

Материал и методы

Проведено проспективное когортное исследование у пациентов с злокачественными глиомами (Grade III—Grade IV) полушарной локализации, которые оперированы в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» с декабря 2018 г. по июнь 2019 г. Критериями включения в это исследование были возраст 18 лет и старше, признаки глиальной опухоли при магнитно-резонансной томографии (МРТ), верифицированнные после операции гистологически; возможность субтотальной резекции опухоли (более 90% контрастируемой части); оценка по шкале Карновского 70% и более; информированное согласие на использование препарата Аласенс (действующее вещество — 5-аминолевулиновая кислота).

Критериями исключения были наличие в анамнезе повышенной фоточувствительности или порфирии, болезни печени или биохимические признаки нарушения ее функции.

Критериям включения отвечали 14 пациентов (8 мужчин и 6 женщин) в возрасте от 20 до 78 лет. По локализации опухоли пациенты распределились следующим образом: височная — 5, лобная — 4, теменная, затылочная, лобно-височная, височно-теменная и теменно-затылочная — по одному пациенту; у 5 пациентов опухоль локализовалась в доминантном и у 9 — в субдоминантном полушарии. Впервые выявленная глиобластома была у 9 пациентов, продолженный рост опухоли — у 5 пациентов, у 1 из них глиобластома височной локализации диагностирована через 7 лет после хирургического и адъювантного лечения анапластической астроцитомы этой же локализации. Этическим комитетом ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России дано разрешение на применение 5-АЛК в хирургии опухолей мозга. Кроме того, клинические рекомендации по использованию флуоресцентной диагностики в хирургии опухолей мозга одобрены правлением Ассоциации нейрохирургов РФ и опубликованы в рецензируемом журнале [15].

Методы

Пациенты за 2 ч до операции получали перорально препарат 5-АЛК 20 мг на 1 кг массы тела (Аласенс, ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Россия). Для профилактики фототоксического эффекта в течение 24 ч после операции пациентов ограждали от прямых солнечных лучей. Во время операции использовали микроскоп OPMI Pentero (Carl Zeiss Meditec AG, Германия) с флуоресцентным модулем (BLUE-400). В зависимости от локализации опухоли применяли нейрофизиологический мониторинг вызванных моторных или сенсорных потенциалов, а также прямую стимуляцию (электромиограф Viking Select, Nicolet, США).

При визуализации опухоли на поверхности мозга или субкортикально до начала ее удаления включали режим флуоресценции для подтверждения факта флуоресценции опухолевой ткани или сосудов. Удаление опухоли осуществляли под микроскопом, как правило, в режиме белого света вакуумным и/или ультразвуковым отсосом. Для дополнительной оценки границ опухоли, степени радикальности ее удаления применяли режим флуоресценции, а также ультразвуковой контроль. Фрагменты опухоли отправляли для гистологического и молекулярно-генетического анализа. После удаления основной массы опухоли при визуализации флуоресцирующих сосудов в структуре опухоли или на границе с перифокальной тканью сначала оценивали их функциональную значимость и затем резецировали для последующего гистологического исследования. Возможность резекции сосуда определяли с учетом анатомической локализации, а также стабильности нейрофизиологических параметров при его временном выключении. Всем пациентам после операции в 1-е сутки после операции выполняли компьютерную томографию (КТ) или МРТ для определения объема пострезекционной полости и исключения осложнений.

Для морфологических исследований биопсийный материал фиксировали в формалине, заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином. Кроме того, у 4 пациентов проведено иммуногистохимическое исследование с применением моноклональных антител к глиальному маркеру GFAP. Молекулярно-генетическое исследование биопсийного материала проведено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с помощью ДНК-кодов для выявления мутаций в генах IDH1 и IDH2, а также метилирования промотора гена MGMT.

Результаты

Результаты исследований показали, что у 10 из 14 пациентов диагностирована глиобластома (Grade IV) с отсутствием мутации в генах IDH1 и IDH2, при этом у 3 из них выявлено наличие метилирования промотора гена MGMT и у 7 этот признак отсутствовал. У 4 пациентов диагностированы анапластические (Grade III) глиомы, из них у 2 — анапластическая астроцитома, у 1 — анапластическая олигодендроглиома и еще у 1 — анапластическая плеоморфная ксантоастроцитома. У 2 пациентов с глиомами Grade III выявлена мутация в гене IDH1с наличием метилирования промотора гена MGMT, у 1 — мутация в гене BRAF.

Данные интраоперационных исследований показали, что у всех 10 пациентов c глиобластомой отмечалась гомогенная или гетерогенная флуоресценция опухолевой ткани, при этом как обычно не флуоресцировала зона некроза, а наиболее ярко флуоресцировали солидная и инфильтративная части опухоли. По мере удаления опухоли отмечалось снижение яркости флуоресценции и в перифокальной зоне наблюдалось бледно-розовое свечение либо его отсутствие. У всех пациентов в зоне некроза выявлялась разнокалиберная сосудистая сеть аномальных тонкостенных нефлуоресцирующих сосудов.

В 4 из 10 наблюдений c глиобластомами после удаления основной массы опухоли в ложе выявлялись сосуды с гомогенно или фрагментарно флуоресцирующими стенками (рис. 1—3).

Рис. 1. Глиобластома затылочной доли справа (клиническое наблюдение 1). а, б, в — МРТ головного мозга до операции. а — в режиме Т2 опухоль солидно-кистозного строения, с умеренно выраженным перифокальным отеком; б — при введении контрастного вещества в режиме Т1 отмечаются гетерогенное контрастирование солидного узла и накопление контрастного вещества тонкими стенками кистозной части. Стрелкой указан сосуд в структуре опухоли; в — в режиме ASL солидная часть процесса имеет высокие значения CBF (cerebral blood flow, мозговой кровоток) (184,4 мл/100 г/мин); г — интраоперационная картина в белом свете; д — интраоперационная картина в режиме флуоресценции: виден ярко флуоресцирующий крупный сосуд (более мелкий сосуд не флуоресцирует).

Рис. 2. Интраоперационный вид при удалении глиобластомы правой теменной доли (клиническое наблюдение 2). а, б, — в белом свете микроскопа; в, г — в флуоресцентном режиме микроскопа BLUE-400.

Рис. 3. Интраоперационные фотографии на этапах хирургического вмешательства (клиническое наблюдение 3). а — вид опухоли правой лобно-височной локализации; б, в — вид опухоли правой височно-теменной локализации в белом свете микроскопа; г — в режиме флуоресценции видна флуоресценция опухоли на поверхности; д, е — в режиме флуоресценции видны фрагменты опухоли в процессе удаления и флуоресценция сосудов.

У 2 из 4 пациентов с анапластическими астроцитомами (Grade III) отмечалась флуоресценция опухолевой ткани, при этом флуоресценции сосудов не было.

Результаты гистологического и иммуногистохимического исследований

Детальное микроскопическое изучение и анализ образцов сосудистой стенки с флуоресценцией и без флуоресценции показал, что во всех 4 образцах сосудов, в которых интраоперационно определена флуоресценция стенки, выявлена инвазия опухоли в васкулярные слои (рис. 4).

Рис. 4. Результаты гистологического (а—в) и иммуногистохимического (г) исследований сосуда с флуоресценцией стенки. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×200. Границы опухоли обозначены красной пунктирной кривой, наружный контур сосуда — синей кривой, граница между наружным и средним мышечным слоем — голубой кривой, между средним и внутренним эндотелиальным слоем — зеленой кривой, внутренний контур сосуда — темно-фиолетовой кривой. Просвет сосуда обозначен буквой «П», эндотелиальный слой — буквой «Э», мышечный слой — буквой «М», адвентициальный наружный слой — буквой «А», опухоль — буквой «О», перифокальная зона — буквой «З»; а — общий вид сосуда с очаговым врастанием опухолевых клеток в его наружном слое (указано стрелками); б — участок очагового врастания опухолевой ткани в сосуд, при этом заметна небольшая тенденция к расширению врастания и появлению диффузного характера роста в наружном слое сосуда (указано стрелками); в — зона диффузного врастания опухоли в наружной слой сосудистой стенки. Заметно наличие диффузной инфильтрации наружного слоя сосудистой стенки опухолевыми клетками (указано стрелками); г — иммуногистохимическое исследование с моноклональными антителами к маркеру GFAP. Видно позитивное коричневое окрашивание пероксидазных меток в ткани опухоли, врастающей в наружный слой сосудистой стенки.

Наиболее часто инвазия опухолевых клеток наблюдалась в адвентициальный слой сосуда, однако характер инфильтрации сосудов опухолью отличался не только в различных клинических случаях, но и на разных участках одного и того же сосуда, причем для обнаружения данного феномена необходимо было осуществить серийные срезы препарата сосудистой стенки. Так, в случае, представленном на рис. 4, а, б, наблюдалась неравномерно выраженная инвазия в наружный васкулярный слой, в котором опухолевые клетки формировали языковидный врастающий фрагмент, инфильтрирующий ткани. При этом структура наружного слоя была существенно нарушена, клетки утратили свое правильное, параллельное просвету расположение, волокна имели аберрантный ход. Кроме того, выявлялись и изменения среднего слоя: истонченный и образованный дистрофичными мышечными элементами, он характеризовался низкой плотностью клеток и их несколько разрозненным расположением. Дистрофические изменения в значительной мере затронули и внутренний слой сосуда, что особенно заметно по истонченному и дисморфичному виду эндотелиоцитов.

В то же время при изучении другого фрагмента того же сосуда, показанного на рис. 4, в, выявлено некоторое изменение характера прорастания опухоли в наружный слой, что выражалось в двух важнейших морфологических признаках. Во-первых, распространение опухолевых клеток в наружном слое стало не очаговым, а в большей степени диффузным, занимающим практически всю площадь наружного васкулярного слоя. Вследствие этого большая часть тканей наружного слоя оказалась фактически замещенной опухолевыми инфильтратами, сохранив лишь небольшие островки нормальных васкулярных клеток с выраженными явлениями дистрофии в них. Во-вторых, и этот признак логически взаимосвязан с первым, характер роста опухоли определил крайне плотное прилегание опухолевой ткани к среднему слою сосуда с выраженной дистрофией и дезорганизацией гладкомышечных клеток данного слоя, но в отличие от предыдущего уровня врастания, подобное распространение опухоли наблюдалось практически вдоль всей окружности сосуда.

Однако в некоторых сосудах опухолевые клетки распространялись глубже, инфильтрируя не только наружный, но и средний мышечный слой (рис. 5).

Рис. 5. Результаты гистологического исследования сосуда с флуоресценцией стенки. Окраска гематоксилином и эозином. а — инфильтрация опухолевыми клетками наружного слоя сосудистой стенки с микроинвазией в средний, мышечный слой (указаны стрелками), увеличение ×200. Красная пунктирная кривая обозначает границы опухоли, голубая кривая — границу между наружным и средним мышечным слоем, зеленая кривая — границу между средним и внутренним эндотелиальным слоем, темно-фиолетовая линия — границу между внутренним слоем и просветом сосуда. Просвет сосуда обозначен буквой «П», эндотелиальный слой — буквой «Э», мышечный слой — буквой «М», адвентициальный наружный слой — буквой «А», опухоль — буквой «О», перифокальная зона — буквой «З»; б — фрагмент сосудистой стенки с инфильтрацией наружного слоя сосуда, увеличение ×400. Опухоль кольцевидно врастает в наружный слой сосуда, нарушая гистиоархитектонику и ламинацию васкулярных слоев по всей окружности сосуда так, что слои невозможно проследить. Красная пунктирная кривая обозначает границы опухоли, синяя кривая — наружный край сосуда, темно-фиолетовая кривая — внутреннюю границу сосуда. Остальные обозначения как на рис. а.

Так, в случае, представленном на рис. 5, а, наблюдался небольшой фрагмент с инвазией опухолевых клеток в средний мышечный слой. Следует отметить, что в данном случае также присутствует гетерогенность инвазивного паттерна: тот же самый сосуд, но на другом участке демонстрирует нам кольцевидный характер врастания лишь в наружный слой сосудистой стенки (см. рис. 5, б). На некоторых участках того же сосуда точно лоцировать инвазивный компонент опухоли по отношению к сосудистым слоям достаточно трудно, так как опухоль нарушала гистиоархитектонику и ламинацию васкулярных слоев по всей окружности сосуда, так что слои невозможно проследить.

Кроме того, обнаружились и обратные примеры, когда опухоль формировала небольшой инфильтративный очаг в наружном сосудистом слое (рис. 6).

Рис. 6. Гистологическое исследование флуоресцирующего сосуда с микроинвазией глиальных опухолевых клеток во внешнюю зону наружного слоя. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×400. Границы опухоли обозначены красной пунктирной кривой, наружный контур сосуда — синей кривой, граница между наружным и средним мышечным слоем — голубой кривой, между средним и внутренним эндотелиальным слоем — зеленой кривой, внутренний контур сосуда — темно-фиолетовой кривой. Просвет сосуда обозначен буквой «П» в кружочке, эндотелиальный слой — буквой «Э», мышечный слой — буквой «М», адвентициальный наружный слой — буквой «А», опухоль — буквой «О», перифокальная зона — «З».

При этом следует отметить, что в том же сосуде имелся участок, к которому опухоль интимно прилегала, однако не инфильтрировала наружный слой сосуда. Данное наблюдение, равно как и предыдущие, еще раз подчеркивает гетерогенность распределения патоморфологических паттернов опухолевой сосудистой инвазии в глиомах. Эта находка, в свою очередь, имеет важное практическое следствие — морфологическая верификация феномена инфильтративного роста в сосуд возможна при условии тщательного гистологического исследования с формированием серийных срезов и их последующим сравнительным анализом с привлечением опытных патологов.

Во всех 4 наблюдениях инвазии сосудов проведено иммуногистохимическое исследование с применением моноклональных антител к глиальному маркеру GFAP. Это позволило четко выделить участки врастания опухолевых клеток в сосудистую стенку и подтвердить сделанные ранее выводы. Более того, стало возможным более точно оценить истинное состояние наружного слоя сосуда. Выяснилось, что в некоторых случаях инфильтрация его опухолью более плотная и выраженная, чем по данным простого гистологического исследования с применением окраски гематоксилином и эозином (см. рис. 4, г).

При гистологическом исследовании не флуоресцировавших во время оперативного вмешательства сосудов не было выявлено их инфильтрации опухолью. Большинство патоморфологических изменений в данных сосудах не носило первично опухолевого характера, хотя и могло быть индуцировано вторично, за счет влияния опухоли. Наиболее часто наблюдались изменения, связанные с гипертрофией мышечного слоя, которые могут отражать влияние на состояние структуры сосудистой стенки как общепатологических процессов, таких как атеросклероз, гипертоническая болезнь, так и опухолевой прогрессии (рис. 7).

Рис. 7. Морфологическая картина сосудов без инвазии опухолевых клеток в сосудистую стенку. Фрагменты сосудов, окраска гематоксилином и эозином, а, в — увеличение ×100, б, г — увеличение ×200, д — увеличение ×400. Дифференцируются различные слои сосудистой стенки: наружный слой (отделен от окружающих тканей синей кривой), средний мышечный слой (отделен от наружного слоя голубой кривой, от внутреннего слоя зеленой кривой), внутренний эндотелиальный слой (отделен от среднего слоя зеленой кривой, от просвета сосуда — фиолетовой кривой). а, б, в — выраженная гипертрофия среднего мышечного слоя (участки с наибольшей степенью гипертрофии обозначены двусторонней темно-красной стрелкой); а — участки гипертрофии эндотелиального внутреннего слоя (фрагменты с наибольшей степенью гипертрофии выделены бордовыми двусторонними стрелками); б — гипертрофия наружного слоя (участки с наибольшей степенью гипертрофии обозначены двусторонней бордовой стрелкой); д — опухолевая ткань интимно прилежит к сосудистой стенке, границы опухоли обозначены красной пунктирной кривой.

Патоморфологической основой утолщения мышечного слоя сосуда в данном случае являлась гипертрофия отдельных гладкомышечных клеток, а также их гиперплазия. В 1 случае отмечались выраженная гипертрофия и утолщение наружного слоя сосуда, что также может быть следствием гипертонической болезни и атеросклеротической патологии, но возможно и гипоксическое повреждение под влиянием опухоли. Патоморфологический базис в данном случае также был универсальным независимо от этиологического фактора и характеризовался выраженным гиалинозом и фиброзом.

Обнаружены признаки патологической модификации и эндотелиального слоя в неинвазированных сосудах. Так, в случае, представленном на рис. 7, а, присутствует заметная гипертрофия эндотелия, выраженная неравномерно на разных участках.

Клиническое наблюдение 1

Пациент 20 лет. Глиобластома правой затылочной доли. В неврологическом статусе — левосторонняя гемианопсия, цефалгический синдром.

Удаление опухоли выполнено с использованием ультразвуковой навигации (УЗ-навигации), нейрофизиологического контроля и флуоресцентной навигации. Солидная часть опухоли хорошо флуоресцировала; после удаления у ее медиального края, примыкавшего к фальксу, обнаружено два сосуда, более крупный из них гомогенно и ярко флуоресцировал. Результаты исследований флуоресцирующего сосуда представлены на рис. 1. После коагуляции дистального и проксимальных отрезков сосуды резецированы и отправлены на гистологическое исследование.

Послеоперационное течение у пациента стабильное, через 7 дней выявилось улучшение полей зрения (до операции — левосторонняя гемианопсия, после операции — нижнеквадрантная гемианопсия).

По данным гистологического и молекулярно-генетического исследований: глиобластома (Grade IV). Мутации в кодоне 132 в гене IDH1 и в кодоне 172 в гене IDH2, а также метилирование промотора гена MGMT не выявлены.

Клиническое наблюдение 2

Пациент 59 лет. Диагноз — глиобластома правой теменной доли. В клиническом статусе до операции выявлена левосторонняя пирамидная симптоматика. 16.01.19 — операция: микрохирургическое удаление глиобластомы правой теменной доли с применением нейрофизиологического мониторинга, флуоресцентной и УЗ-навигации и навигационной системы Fiagon (Германия). После удаления основной массы опухоли в ложе выявлен флуоресцирующий сосуд, который резецирован и отправлен на гистологическое исследование. На рис. 8 представлены

до- и послеоперационные изображения МРТ. Приведены интраоперационные изображения ложа после удаления основной массы опухоли в обычном свете (рис. 2 а, б) и флуоресцентном (см. рис. 2 в, г) режиме.

Результаты морфологического и молекулярно-генетического исследований: глиобластома (Grade IV). Мутации в кодоне 132 в гене IDH1 и в кодоне 172 в гене IDH2 не выявлены. Метилирование промотора гена MGMT не обнаружено.

Клиническое наблюдение 3

Пациентка 63 лет. По месту жительства 09.08.18 выполнено удаление глиобластомы правой височной доли (рис. 9, а).

Лучевая и химиотерапия после операции не проводились.

При поступлении в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. ак. Н.Н. Бурденко» (20.01.19) выявлены цефалгический синдром, сглаженность левой носогубной складки, нечеткость речи, дезориентировка во времени и пространстве, снижение памяти на текущие события, апатичность, вялость. При МРТ обнаружены признаки продолженного роста опухоли с расширением зоны контрастирования в правой лобно-височной и правой височно-теменной областях (см. рис. 9, б). Выполнена повторная операция — удаление глиобластомы правой лобно-височной и правой височно-теменной локализации с нейрофизиологическим мониторингом, ультразвуковой и фуоресцентной навигацией. В процессе удаления хорошо флуоресцирующей опухоли в ее структуре, а также в ложе опухоли выявлялись также и флуоресцирующие сосуды (см. рис. 3), которые резецированы и отправлены на гистологическое исследование. В послеоперационном периоде — регресс общемозговой симптоматики без нарастания очаговой симптоматики (см. рис. 9, в).

Результаты морфологического и молекулярно-генетического исследований: глиобластома (Grade IV). Отсутствие мутации R132Н в гене IDH1 и в 172 кодоне в гене IDH2. Метилирование промотора гена MGMT не выявлено.

На рис. 6 видно, что фрагментарная инвазия опухоли (О) в наружный адвентициальный слой сосуда (А) не достигает среднего мышечного слоя (М).

Обсуждение

Для реализации основной цели работы проведено проспективное когортное исследование пациентов с глиомами полушарной локализации, оперированных с использованием флуоресцентной диагностики. Особенностью 10 наших наблюдений пациентов с глиобластомами было отсутствие мутаций в кодоне 132 в гене IDH1 и в кодоне 172 в гене IDH2, что, по мнению ряда авторов [16], может свидетельствовать о первичной природе глиобластом. Однако в одном нашем наблюдении глиобластома была вторичной в результате трансформации через 7 лет после хирургического удаления и адъювантного лечения анапластической астроцитомы (Grade III). Другой особенностью 7 из 10 наблюдений глиобластом было отсутствие метилирования промотора гена MGMT как прогностически неблагоприятного признака [17, 18].

Следует отметить, что эффект яркой флуоресценции опухолевой ткани наблюдался у пациентов как при впервые выявленной глиобластоме, так и при повторных операциях по поводу продолженного роста, а также при вторичной глиобластоме, что подтверждают и результаты предыдущих работ [8].

В 4 из 10 наших наблюдений после удаления основной массы флуоресцирующей глиобластомы флуоресцировали сосуды, в то время как сосудистая сеть самой опухоли не флуоресцировала. Вполне очевидно, что в структуре опухоли, ее перифокальной зоне и ложе удаленной опухоли имеются сосуды разного функционального значения: интактные сосуды мозга, обеспечивающие кровоснабжение нормальных структур мозга и граничащих с опухолью, сосуды, кровоснабжающие и нормальную ткань, и опухоль и, наконец, сосуды опухоли, образованные de novо как результат ангионеогенеза [19—21]. У 2 из 4 пациентов с анапластическими астроцитомами (Grade III) отмечалась мутация гена IDHI с наличием метилирования гена MGMT, и при этом у них опухолевая ткань не флуоресцировала. У 2 других пациентов во время операции отмечалась флуоресценция опухолевой ткани, но у них отсутствовали признаки метилирования гена MGMT и признаки мутации генов IDHI, IDH2 и гена BRAF. Таким образом, у 12 из 14 пациентов с глиомами высокой степени злокачественности (Grade III—Grade IV) отмечалась флуоресценция опухоли, но только у 4 пациентов с глиобластомами (Grade IV) флуоресцировали также сосуды. У 1 пациента с продолженным ростом диффузной астроцитомы (Grade I) после хирургического вмешательства и лучевой терапии при повторном вмешательстве отмечалась яркая флуоресценция опухоли без флуоресценции сосудов.

В отличие от нормальных кровеносных сосудов, сосудистая сеть опухоли, особенно глиобластомы, обладает высоким пролиферативным потенциалом, что сопровождается необычными молекулярными свойствами [19, 22, 23]. Опухолевые кровеносные сосуды не имеют типичных функциональных особенностей, обнаруживаемых в нормальных сосудах. Морфологически опухолевые сосуды более извилистые, чем нормальные мозговые сосуды; вследствие своего аберрантного роста многие сосудистые стволы слепо заканчиваются без перехода в нижележащие по течению сосудистые элементы, что создает в опухоли гипоксические области. Кроме того, в архитектонике сосудистой системы наблюдается большая распространенность артериоло-венулярных шунтов, отличающихся хрупкой структурой, повышающей риск развития кровоизлияния [22].

Гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином показало наличие инфильтрации опухолевыми клетками наружной стенки флуоресцирующих сосудов и отсутствие этого феномена в нефлуорецирующих сосудах опухоли. Кроме того, проведено иммуногистохимическое исследование с применением моноклональных антител к глиальному маркеру GFAP. Поскольку данный белок является маркером глиальных клеток [24], его идентификация позволила четко выделить участки врастания опухолевых клеток в сосудистую стенку и подтвердить причину флуоресценции исследованных сосудов. Использование этого метода позволило установить, что инфильтрация в этом случае сосуда опухолью была более плотная и выраженная, чем по данным простого гистологического исследования с применением окраски гематоксилином и эозином (см. рис. 4, г).

В одном из фрагментов сосудистой стенки выявлено два важнейших морфологических признака (см. рис. 4). Первый из них свидетельствовал о том, что распространение опухолевых клеток в наружном слое было не только очаговым, но и в большей степени диффузным, занимающим весь наружный васкулярный слой. Вследствие этого, большая часть наружного слоя оказалась фактически замещенной опухолевыми инфильтратами, сохранив лишь небольшие островки нормальных васкулярных клеток с выраженными явлениями дистрофии в них. Второй признак логически взаимосвязан с первым: характер роста опухоли определил крайне плотное прилегание опухолевой ткани к среднему слою сосуда с выраженной дистрофией и дезорганизацией гладкомышечных клеток данного слоя, но в отличие от предыдущего уровня врастания, подобное распространение опухоли наблюдалось практически вдоль всей окружности сосуда (см. рис. 4, в).

Таким образом, результаты гистологического и гистохимического исследований показали, что факт флуоресценции сосудов означает их инфильтрацию опухолевыми клетками, следовательно, этот ранее не описанный феномен требует дальнейшего изучения, поскольку эти сосуды могут быть потенциальными источниками распространения опухолевых клеток и продолженного роста опухоли.

Применение флуоресцентной диагностики с 5-аминолевулиновой кислотой для оценки границ опухоли и перифокальных тканей оказалось принципиально новым и уникальным подходом в интраоперационной экспресс-диагностике сосудов, инфильтрированных опухолью.

Впервые описан еще один потенциальный механизм подобного взаимодействия: опухолевые клетки могут инвазировать ранее интактные мозговые сосуды. Этот механизм может также способствовать прогрессированию опухолевого процесса и диссеминации различных видов глиомных клеток, в частности глиомных стволовых клеток, роль которых в последние годы интенсивно изучается [21, 25—29].

Проведенное исследование направлено на решение актуальной проблемы — определение степени радикальности хирургического лечения глиом и необходимости резекции сосудов, накапливающих 5-AЛК, так как ее накопление в сосудистой стенке может быть маркером наличия опухолевой васкулярной инвазии. Хирургическая резекция такого сосуда позволяет устранить лишь один из возможных механизмов дальнейшего прогрессирования глиомы. Безусловно, в данном случае требуется взвешенный подход, учитывающий функциональную значимость потенциально пораженного сосуда. Это подчеркивает необходимость в дооперационном периоде всесторонней оценки локализации опухоли, ее кровоснабжения и взаимоотношения с окружающими сосудами с применением современных ангиографических, перфузионных и радионуклидных технологий — магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии, позитронно-эмиссионной томографии. С патогистологических позиций важны точное и всестороннее изучение и анализ биопсийного материала, поскольку приведенные нами примеры показывают, что порой имеется лишь микроинвазия в сосудистую стенку, и установить ее без проведения серийных срезов с их последовательным гистологическим изучением не представляется возможным. Во время операции визуализация сосудов в структуре опухоли с помощью оптических инструментов (микроскопа, эндоскопа) и флуоресценции с 5-AЛК может быть дополнена ультразвуковым сканированием в ангиорежиме, флуоресценцией сосудов с применением индигокармина зеленого.

Продолжается интенсивное исследование перспектив интраоперационного использования новых оптических технологий, таких как кросс-поляризационная оптическая когерентная томография, конфокальная лазерная эндомикроскопия с получением изображений высокого разрешения ткани мозга, опухоли и сосудистой сети и др. [30—35].

Недостаток данной работы — короткий катамнез и небольшая серия наблюдений, в которую включены пациенты с глиомами разной степени злокачественности, в том числе 2 пациента, ранее оперированных в других учреждениях без последующей адьювантной терапии. Представляется необходимым изучение вопроса о возможной флуоресценции сосудов глиом меньшей степени злокачественности и опухолей другой гистологической и молекулярно-генетической природы.

Выводы

Интраоперационная флуоресценция с применением 5-аминолевулиновой кислоты является принципиально новым подходом в экспресс-диагностике сосудов, инфильтрированных опухолью. Инвазия опухолевыми клетками ранее интактных сосудов может являться механизмом, посредством которого осуществляются прогрессирование и диссеминация опухолевого процесса. Дополнительная резекция флуоресцирующих сосудов может влиять на радикальность хирургического лечения при условии обязательной оценки их функциональной значимости.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.П., С.Ч., В.О., М.Р., И.П., Т.С., В.Л., В.Ч.

Сбор и обработка материала — П.Н., В.О., С.Г., А.К., А.М., Д.Ч., А. Б, Г. Д., Т.С.

Статистическая обработка — С.Ч., В.О., С.Г., А.К., А.М., Д.Ч., Г. Д.

Написание текста — А.П., В.О., С.Г., А.К., А.М., Д.Ч., М.В., Н.З., А.Б., И.П., Г. Д., Т.С., В.Л., К.Я., В.Ч.

Редактирование — А.П., С.Ч., П.Н., В.О., С.Г., А.К., А.М., Д.Ч., М.Р., Н.З., А.Б., И.П., Г. Д., Т.С., В.Л., К.Я., В.Ч.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 17−00−00158 «Исследование клинических и молекулярно-генетических паттернов глиом головного мозга человека с длительным периодом общей выживаемости»).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Потапов А.А. — https://orcid.org/0000-0001-8343-3511

Чобулов С.А. — https://orcid.org/0000-0002-3873-6246

Никитин П.В. — https://orcid.org/0000-0003-3223-4584

Охлопков В.А.— https://orcid.org/0000-0001-8911-2372

Горяйнов С.А. — https://orcid.org/0000-0002-6480-3270

Косырькова А.В. — https://orcid.org/0000-0002-3019-5203

Маряхин А.Д. — https://orcid.org/0000-0001-9384-0129

Чёлушкин Д.М. — https://orcid.org/0000-0003-3599-7237; e-mail: nociceptor@yandex.ru

Рыжова М.В. — https://orcid.org/0000-0001-7206-6365

Захарова Н.Е. — https://orcid.org/0000-0002-0516-3613

Баталов А.И. — https://orcid.org/0000-0002-8924-7346

Пронин И.Н.— https://orcid.org/0000-0002-4480-0275

Данилов Г.В. — https://orcid.org/0000-0003-1442-5993

Савельева Т.А.— https://orcid.org/0000-0001-9833-716X

Лощенов В.Б. — https://orcid.org/0000-0002-0507-2367

Яшин К.С. — https://orcid.org/0000-0002-5723-7389

Чехонин В.П. — https://orcid.org/0000-0003-4386-7897

Автор, ответственный за переписку: Чёлушкин Д.М. — e-mail: nociceptor@yandex.ru

Комментарий

В статье обсуждается важный вопрос оценки радикальности удаления глиобластом: впервые описано применение флуоресценции с 5-АЛА для интраоперационной экспресс-диагностики пораженных опухолью сосудов. Проведенное исследование доказывает необходимость резекции накапливающих 5-АЛА сосудов ввиду возможности инвазии стенки сосуда клетками опухоли. Согласно данным литературы, кровеносные сосуды не аккумулируют флуоресцирующий агент, вследствие чего накопление стенкой сосуда 5-АЛА можно расценивать как инвазию опухолевыми клетками сосудистой стенки и периваскулярных тканей. Резекция пораженного сосуда (при ее анатомической и физиологической возможности) позволяет исключить один из путей прогрессирования опухоли. Использование новых оптических нейровизуализационных технологий открывает широкие перспективы для улучшения радикальности удаления злокачественных опухолей.

Данное исследование является уникальным и будет интересно и полезно нейрохирургам, занимающимся, в частности, хирургией злокачественных опухолей головного мозга, а также специалистам, использующим интраоперационную флуоресцентную диагностику в нейроонкологии.

В.А. Лазарев (Москва)

Комментарий

Работа коллектива авторов посвящена описанию флуоресценции сосудов в глиобластомах головного мозга. Авторы обладают большим опытом применения флуоресцентной диагностики в хирургическом лечении опухолей головного мозга различной локализации и гистологической природы. Глиобластомы являются ярко флуоресцирующими опухолями, при этом чувствительность флуоресценции составляет до 90—95% (С.А. Горяйнов, А.А. Потапов, 2018, 2019). Однако в структуре опухолей зачастую наблюдается неоангиогенез. Во время хирургических вмешательств авторы обратили внимание на свечение сосудов в структуре глиобластом.

Серия исследуемых пациентов составила 14 человек. У 10 пациентов верифицирована глиобластома, у 4 — анапластическая астроцитома. В 4 из 10 наблюдений c глиобластомами после удаления основной массы опухоли в ложе выявлялись сосуды с гомогенно или фрагментарно флуоресцирующими стенками, у пациентов с анапластическими астроцитомами флуоресценции сосудов не отмечалось. Проведено тщательное гистологическое исследование стенок инфильтрированных опухолью патологических сосудов.

Данная работа дает возможность выявить интраоперационную флуоресценцию пораженных опухолью стенок сосудов и показывает возможный путь прогрессирования заболевания, а именно инфильтрацию опухолевыми клетками сосудистой стенки с последующим распространением опухоли вдоль сосудов.

А.Х. Бекяшев (Москва)