Кортексин, Церебролизин и Актовегин содержат комплекс естественных биологически активных веществ, обеспечивающих защиту нейронов, способствующих нейропластичности и нейрогенезу, улучшающих энергетический обмен и трофику головного мозга (ГМ). Кортексин и Церебролизин содержат полипептиды ГМ крупного рогатого скота или свиней и оказывают выраженное нейропротективное действие при нарушениях мозгового кровообращения [1—4]. Кортексин — российский полипептидный препарат, который в отличие от Церебролизина изготавливают из коры ГМ. Актовегин — высокофильтрованный экстракт крови телят, улучшающий метаболизм ткани мозга [5—8].
Цель исследования — оценить влияние курсовой терапии препаратами Кортексин, Церебролизин и Актовегин на состояние памяти, мозговое кровообращение и структуру гиппокампа у крыс с хроническим нарушением мозгового кровообращения (ХНМК).
Материал и методы
Эксперимент выполнен на 144 самцах крыс, масса тела 300—350 г (Филиал «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» РАМН (Московская обл.)) в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза. Протокол исследования одобрен Региональным независимым этическим комитетом, регистрационный номер ИРБ 00005839 IORG 0004900 (OHRP), протокол №132 от 20 мая 2019г.
ХНМК моделировали посредством стенозирования общих сонных артерий (ОСА) на 50%. В качестве анестезии использовали золетил/ксилазил в дозе 20/8 мг/кг (в/б). Схема операции представлена на рис. 1 и подробно описана в предыдущих работах [9], дизайн исследования представлен на рис. 2. Исследование включало моделирование ХНМК, контроль развития неврологического дефицита через 40 дней, два 10-дневных периода лечения (лекарственные препараты вводили ежедневно, однократно внутримышечно), разделенных 10-дневным перерывом. В конце каждого периода животных тестировали в водном лабиринте Морриса (ВЛМ), тестах условной реакции пассивного избегания (УРПИ) и экстраполяционного избавления (ТЭИ). В ВЛМ оценивали обучаемость и сохранение пространственной памяти в процессе 4-дневного обучения поиску затопленной платформы [10]. В тестах УРПИ и ТЭИ определяли сохранность навыка пассивного избегания и активного избавления от аверсивной среды, обучение которым проводили до моделирования патологии [11]. В конце эксперимента определяли уровень мозгового кровотока методом лазерной допплерографии («Biopac Systems Inc.», США). После эвтаназии ГМ извлекали и исследовали патоморфологические изменения в CA1 и CA4 зонах гиппокампа. Морфометрию проводили на окрашенных по методу Ниссля срезах. Степень поражения оценивали по трем категориям: нормальные нейроны (НН); слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториалъная ацидофилия); грубоизмененные нейроны (ГН) — выраженное сморщивание, гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени. Кортексин и Церебролизин вводили в дозах, составляющих 1/3 терапевтической дозы (ТД), ТД и 3 ТД, Актовегин — только в ТД [12—14] (табл.1).
Рис. 1. Общий принцип моделирования стеноза общих сонных артерий: ОСА — общая сонная артерия; НСА — наружная сонная артерия; ВСА — внутренняя сонная артерия; СМА — средняя мозговая артерия.
Рис. 2. Дизайн исследования.
Таблица 1. Характеристика групп животных
| Группа животных | Доза | n | |
| Интактная группа | — | — | 15 |
| Плацебо | — | — | 16 |
| Кортексин | 1/3 ТД | 0,3 мг/кг | 16 |
| ТД | 1,0 мг/кг | 17 | |
| 3 ТД | 3,0 мг/кг | 16 | |
| Церебролизин | 1/3 ТД | 0,83 мл/кг | 16 |
| ТД | 2,5 мл/кг | 16 | |
| 3 ТД | 7,5 мл/кг | 16 | |
| Актовегин | ТД | 5 мл/кг | 16 |
Примечание. n — число животных.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием Microsoft Office Excel 2016 («Microsoft», США) и Prism 6 («GraphPad Software Inc.», США), критерия Данна и t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки (M±m).
Результаты
Оценка формирования и воспроизведения памятного следа в ВЛМ
Тест ВЛМ проводили с 6-го по 10-й день после начала лечения, а затем с 6-го по 10-й день после отмены лечения и с 6-го по 10-й день после повторного курса терапии: ежедневно 4 раза в день животное помещали в определенные зоны бассейна по одинаковой схеме и фиксировали латентный период нахождения площадки (табл. 2). На протяжении всего эксперимента в ВЛМ животные группы плацебо значимо дольше искали затопленную платформу по сравнению с интактной группой (p<0,05). В конце первого курса лечения на 4-й день площадку быстрее находили животные интактной группы и получавшие Кортексин в дозе 1 или 3 мг/кг (p<0,05), Церебролизин (2,5 или 7,5 мл/кг; p<0,05) или Актовегин.
Таблица 2. Среднее время нахождения площадки за 4 попытки в ВЛМ у животных с ХНМК в 3 экспериментальных периодах (с, M±m)
| Группа | 1-й период | 2-й период | 3-й период | |||
| 1-й день | 4-й день | 1-й день | 4-й день | 1-й день | 4-й день | |
| Интактная (n=15) | 33,9±2,4 | 14,0±2,2 | 17,8±1,9 | 11,3±1,8 | 15,7±1,9 | 9,4±1,3 |
| Плацебо (n=13) | 45,3±1,3# | 46,8±13,2# | 41,8±4,5# | 31,1±4,2# | 42,3±4,2# | 34,7±4,9# |
| Δ% от интактной группы | 34 | 235 | 134 | 175 | 169 | 270 |
| Кортексин (0,3 мг/кг; n=14) | 43,0±3,2 | 28,5±3,8 | 26,4±4,3* | 18,0±3,5 | 29,9±3,9 | 22,8±4,2 |
| Δ% от группы плацебо | –5 | –39 | –37 | –42 | –29 | –34 |
| Кортексин (1 мг/кг; n=15) | 45,9±2,7 | 22,4±4,1* | 23,0±3,2* | 22,6±3,5 | 20,8±2,9* | 22,2±3,7 |
| Δ% от группы плацебо | 1 | –52 | –45 | –27 | –51 | –36 |
| Кортексин (3 мг/кг; n=14) | 42,5±2,6 | 27,6±3,8 | 27,2±3* | 22,8±3,1 | 29,4±4,3 | 19,7±3,3* |
| Δ% от группы плацебо | –6 | –41 | –35 | –27 | –31 | –43 |
| Церебролизин (0,83 мл/кг; n=15) | 45,4±2,7 | 31,6±3,7 | 36,8±3,5 | 32,5±3,8 | 36,8±3,6 | 35,5±3,8 |
| Δ% от группы плацебо | 0 | –32 | –12 | 4 | –13 | 2 |
| Церебролизин (2,5 мл/кг; n=15) | 43,5±3,4 | 19,7±3,2* | 17,0±2,3* | 19,8±3,6 | 18,6±3,4* | 16,8±2,8* |
| Δ% от группы плацебо | –4 | –58 | –59 | –36 | –56 | –52 |
| Церебролизин (7,5 мл/кг; n=13) | 45,2±2,6 | 30,4±5,2 | 37,3±4,2 | 24,8±4,4 | 23,5±3,7* | 22,8±4,1 |
| Δ% от группы плацебо | 0 | –35 | –11 | –20 | –44 | –34 |
| Актовегин (5 мл/кг; n=15) | 38,3±2,5 | 27,4±3,1 | 25,9±3,6* | 21,9±3,7 | 24,8±3,8* | 16,1±3,1* |
| Δ% от группы плацебо | –15 | –42 | –38 | –30 | –41 | –54 |
Примечание. Здесь и в табл. 3—6: 1-й период — через 10 сут лечения; 2-й период — через 10 сут после периода отмены лечения; 3-й период — через 10 сут повторного периода лечения; # — различия статистически значимы по сравнению с интактной группой при p<0,05, t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони; * — различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо при p<0,05, t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони.
В период отмены лечения (см. табл. 2) в группах, получавших Кортексин в дозах 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг, а также Церебролизин в дозе 2,5 мл/кг и Актовегин, отмечено, что в отличие от контрольных животные затрачивали на поиск платформы значимо меньше времени. В группе, получавшей Кортексин, в отличие от Церебролизина, эффективность не зависела от дозы.
В конце повторного курса лечения (см. табл. 2) значительное улучшение показателей в ВЛМ относительно контрольной группы наблюдалось у животных, которым вводили Кортексин, Церебролизин или Актовегин в 1 или 3 ТД. Перерывы в тестировании не приводили к угасанию памятного следа, что отмечалось у животных, получавших плацебо. Таким образом, в результате проведенного исследования было отмечено положительное сопоставимое влияние курсового введения Кортексина или Церебролизина на формирование и воспроизведение памятного следа в ВЛМ.
Оценка памяти в тестах УРПИ и ТЭИ
Формирование и проверку выработки навыков в тестах УРПИ и ТЭИ проводили за 24 ч до моделирования ХНМК. Все животные, включенные в исследование, успешно воспроизводили выученные навыки до операции: не заходили в темный отсек, в котором на этапе обучения получали электроболевое воздействие (УРПИ) и быстро выполняли экстраполяционную задачу в ТЭИ (табл. 3 и 4). Через 39 дней после моделирования ХНМК проводили оценку сохранности памятного следа в тестах УРПИ и ТЭИ, затем повторяли тестирование 3 раза: после 10 дней лечения, 10 дней отмены и 10 дней повторной терапии.
Таблица 3. Среднее время захода и число животных с ХНМК, зашедших в темный отсек установки УРПИ (с, M±m)
| Группа | Латентный период захода в темный отсек | |||||
| обучение | до операции | до лечения | период после начала лечения | |||
| 1-й | 2-й | 3-й | ||||
| Интактная (n=15) | 41±6,9 | 180±0,0 | 180±0,0 | 180,0±0,00 | 180,0±0,00 | 180,0±0,00 |
| Плацебо (n=13) | 37±8,4 | 180±0,0 | 134±20,0# | 121,0±21,6# | 104,8±23,5# | 84,5±22,2# |
| N | 13 | 0 | 4 | 5 | 6 | 8 |
| Кортексин (0,3 мг/кг; n=14) | 33±6,2 | 180±0,0 | 149±16,8 | 149,1±16,5 | 147,7±17,4 | 140,0±18,0 |
| N | 14 | 0 | 3 | 3 | 3 | 4 |
| Кортексин (1 мг/кг; n=15) | 38±5,7 | 180±0,0 | 149±16,4 | 160,1±13,7 | 159,7±13,9 | 168,5±11,5* |
| N | 15 | 0 | 3 | 2 | 2 | 1 |
| Кортексин (3 мг/кг; n=14) | 45±10,2 | 180±0,0 | 151±16,3 | 156,6±15,9 | 158,6±14,6 | 169,1±10,9* |
| N | 14 | 0 | 3 | 2 | 2 | 1 |
| Церебролизин (0,83 мл/кг; n=15) | 30±9,2 | 180±0,0 | 141±17,3 | 141,7±17,0 | 138,2±18,9 | 117,1±21,0 |
| N | 15 | 0 | 4 | 4 | 4 | 6 |
| Церебролизин (2,5 мл/кг; n=15) | 49±9,8 | 180±0,0 | 139±18,5 | 168,5±11,5 | 171,9±8,1 | 167,9±12,1* |
| N | 15 | 0 | 4 | 1 | 1 | 1 |
| Церебролизин (7,5 мл/кг; n=13) | 47±12,4 | 180±0,0 | 146±17,9 | 156,8±15,7 | 154,5±17,2 | 152,5±18,6 |
| N | 13 | 0 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Актовегин (5 мл/кг; n=15) | 55±10,6 | 180±0,0 | 140±18,0 | 143,7±16,4 | 129,4±19,3 | 126,7±20,3 |
| N | 15 | 0 | 3 | 4 | 5 | 5 |
Примечание. N — количество животных, зашедших в темный отсек.
Таблица 4. Среднее время решения задачи в ТЭИ животными с ХНМК на всех этапах исследования (с, M±m)
| Группа | Латентный период подныривания | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| обучение | до операции | до лечения | период после начала лечения | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1-й | 2-й | 3-й | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Интактная (n=15) | 15,5±4,61 | 9,5±2,81 | 3,3±0,50 | 3,9±0,60 | 3,3±0,51 | 3,3±0,50 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Плацебо (n=13) | 14,8±4,19 | 11,0±2,83 | 11,9±3,28# | 9,9±1,10# | 7,7±0,52# | 5,5±0,98 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Кортексин (0,3 мг/кг; n=14) | 17,9±3,85 | 9,7±3,40 | 9,9±4,62 | 3,9±0,62* | 5,5±1,34 | 4,7±0,85 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Кортексин (1 мг/кг; n=15) | 15,8±6,13 | 13,0±4,48 | 11,0±4,64 | 3,6±0,52* | 3,3±0,36* | 3,9±0,57 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Кортексин (3 мг/кг; n=14) | Через 39 дней после моделирования ХНМК и до начала лечения по результатам выполнения тестов УРПИ и ТЭИ все группы животных с ХНМК были сопоставимы между собой (см. табл. 3). При повторном воспроизведении навыков через 10 дней терапии, а также через 10 дней отмены лечения в опытных группах наблюдалась тенденция к удлинению времени захода в темный отсек установки УРПИ (см. табл. 3). Статистически значимые различия величины латентного периода захода в темный отсек относительно контрольной группы наблюдались только в конце повторного курса лечения в группах, получавших Кортексин в дозах 1 или 3 мг/кг, или Церебролизин (2,5 мл/кг). В контрольной группе число животных, заходящих в темный отсек установки, увеличивалось с каждым тестированием, и в последней сессии большинство животных зашло в темный отсек, что может свидетельствовать о нарастании дегенеративных процессов и угасании памятного следа. Напротив, в группах животных, получавших Кортексин в дозах 1 или 3 мг/кг или Церебролизин (2,5 мл/кг), меньшее число крыс посещало темный отсек, что объясняется нейропротективным действием препаратов, препятствующим повреждению ГМ и стиранию негативного опыта, приобретенного на этапе обучения. В ТЭИ через 10 дней лечения значимо меньшее время решения экстраполяционной задачи наблюдалось в группах, которым вводили Кортексин или Церебролизин во всех исследуемых дозах. При повторении ТЭИ после отмены лечения значимые различия во времени подныривания наблюдались в группах, получавших Кортексин или Церебролизин в средних или высоких дозах, а также Актовегин. Тестирование животных в конце повторного курса лечения не выявило статистически значимых различий между группами, что, очевидно, связано с закреплением навыка избавления от аверсивной среды и, возможно, с адаптацией к ней. Таким образом, результаты выполнения тестов ВЛМ, УРПИ и ТЭИ свидетельствуют о нарушении процессов формирования и сохранения памятного следа, кратковременной и долговременной памяти у животных с ХНМК. Кортексин, Церебролизин и в меньшей степени Актовегин отчетливо улучшают состояние памяти у животных с ХНМК. Оценка показателей мозгового кровотока у животных с ХНМКВ основе нейропротективного действия исследуемых препаратов может лежать их влияние на гемоциркуляцию в ГМ. Показатели мозгового кровотока у всех животных со стенозом ВСА были ниже, чем у интактных (табл. 5). Таким образом, курсовое введение препаратов Кортексин, Церебролизин и Актовегин не влияет на мозговое кровообращение у животных с ХНМК, а положительное влияние на состояние памяти связано с нейротрофическими и нейрометаболическими эффектами препаратов. Таблица 5. Уровень кровотока в бассейне СМА у животных с ХНМК после курсового лечения (мл/100 г/мин, M±m)
Примечание. # — различия достоверны по сравнению с интактной группой, p<0,05, односторонний ANOVA-тест с поправкой Бонферрони post hoc. Результаты морфологического исследования гиппокампа животных с ХНМКМорфологический анализ структур гиппокампа позволил выявить слабые и умеренно выраженные изменения. В полях CA1 и CA3 дорсального и вентрального гиппокампа выявлены слабые пикноморфные изменения единичных пирамидальных нейронов. Плотность поврежденных нейронов у животных группы плацебо была выше в CA1 и CA3 полях гиппокампа, однако достоверные отличия от группы интактных животных были зафиксированы только в CA1. Анализ морфологических изменений гиппокампа крыс с ХНМК, которым вводили Кортексин, позволил выявить нарастание нейропротективного эффекта по мере увеличения дозы препарата. Терапия Кортексином в дозе 0,3 мг/кг не оказала влияния на характер и выраженность нейродистрофических процессов. Кортексин в дозе 1 и 3 мг/кг способствовал уменьшению количества поврежденных нейронов в соматосенсорной области церебральной коры и нормализации цитоархитектоники CA1 поля гиппокампа. При изучении ГМ животных, которым вводили Церебролизин в дозе 7,5 мл/кг, плотность поврежденных нейронов в области CA1 гиппокампа была наименьшей, что свидетельствует о его протективном действии. Наиболее значимое церебропротективное действие оказали Кортексин в дозах 1 или 3 мг/кг и Церебролизин в дозе 7,5 мл/кг (табл. 6). Результаты морфологического исследования отражают отдаленные последствия, связанные со снижением мозгового кровотока, и позволяют объяснить поведение животных в стандартных тестах, в которых типичными и наиболее очевидными нарушениями функционирования ГМ являлось нарушение памяти. Более выраженные нарушения памяти у животных контрольной группы (плацебо) и ее большая сохранность у животных, получавших Кортексин, Церебролизин и в меньшей степени Актовегин, могут являться следствием меньших структурных изменений ГМ. Таблица 6. Морфологическая характеристика дегенеративных изменений гиппокампа (%, M±m)
Примечание. # — различия статистически значимы в сравнении с интактной группой при p<0,05, критерий Манна—Уитни; * — различия статистически значимы в сравнении с группой плацебо при p<0,05, критерий Манна—Уитни. ЗаключениеВ проведенном эксперименте у лабораторных крыс моделировали 50% стеноз ОСА, который явился причиной ХНМК, что было показано при оценке уровня локального мозгового кровотока, который был в среднем на 28% ниже, чем у интактных животных. Длительная ишемия ГМ, очевидно, стала причиной нарушений памяти: у животных хуже формировались и сохранялись памятный след, пространственная память, что было подтверждено результатами оценки их поведения в тестах ВЛМ, УРПИ и ТЭИ, а также большим количеством измененных нейронов и меньшим — неизмененных в зонах CA1 и CA3 гиппокампа. Введение Кортексина снижало выраженность нарушений памяти у животных с ХНМК. Церебропротекторный эффект Кортексина был наиболее выражен в дозах 1 и 3 мг/кг, был сопоставим с таковым у Церебролизина в дозах 2,5 и 7,5 мл/кг и незначительно превышал таковой у Актовегина (5 мл/кг). Положительный эффект введения Кортексина сохранялся после 10-дневной отмены препарата и усиливался после повторного курса лечения. Курсовое введение Кортексина приводило к снижению выраженности нейродистрофических процессов в CA1 и CA3 гиппокампа у животных с ХНМК. У животных, получавших лечение, уровень мозгового кровотока был выше, но различия с показателями животных, которым вводили плацебо, не достигали статистической значимости. Необходимо отметить, что при сопоставимой эффективности Кортексин в настоящем исследовании применялся в гораздо меньших дозах, чем Церебролизин или Актовегин, что имеет важное значение с точки зрения безопасности и стоимости лечения. Это важно, учитывая социально-экономическую характеристику лиц группы риска или частую инвалидизацию пациентов, перенесших острое или хроническое нарушение мозгового кровообращения. Исследование выполнено при финансовой поддержке ЗАО «Фарм-Холдинг» Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Подтверждение e-mail На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте. Подтверждение e-mail Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||