Биомаркеры ишемии головного мозга как новый метод доказательства эффективности нейроцитопротекторов

Известно, что в настоящее время диагностика ишемического инсульта (ИИ) базируется на клиническом обследовании и данных нейровизуализации [1—3]. Вместе с тем почти в 40% случаев экстренное магнитно-резонансное исследование не может быть проведено в силу противопоказаний или недоступности [4, 5]. Своевременная и точная диагностика ИИ необходима для распределения пациентов и выбора тактики лечения [6, 7]. Быстрый и недорогой лабораторный тест, способный определять биомаркеры головного мозга при ИИ, позволяет существенно снизить затраты, связанные с ненужными госпитализациями и диагностическими ошибками. Одним из перспективных направлений лечения таких пациентов является нейропротективная терапия.

Последнее время в клинике неврологии Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (СПбГМУ) проводятся клинические исследования диагностических биомаркеров, в частности определяется диагностический потенциал NR2-пептида в сопоставлении с неврологическим статусом и данными магнитно-резонансной и компьютерной томографии (МРТ, КТ) головного мозга при остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК).

По данным литературы [8—10], биомаркеры нейротоксичности и окислительного стресса могут сигнализировать о наличии церебральной ишемии. Показано, что N-метил-D-аспартатные (NMDA) возбуждающие рецепторы, расположенные на поверхности микрососудов [10, 11], регулируют процессы вазоконстрикции и вазодилатации и участвуют в развитии нейрососудистых нарушений. Также показано, что NR2-пептид (подвид NMDA-рецепторов) может являться плазменным биомаркером острой церебральной ишемии [12]. В острую фазу ишемического каскада происходит массивный выброс глутамата, который вызывает дизрегуляцию NMDA-рецепторов [13], в частности на клетках эндотелия мозговых микрососудов [11]. При этом N-концевые фрагменты NR2-субъединиц быстро отщепляются сериновыми протеазами и попадают в кровоток, где возможно определение NR2-пептидных фрагментов с молекулярным весом около 5 kD [12].

Цель данной работы — определение диагностических возможностей NR2-пептидного теста у пациентов с ИИ, а также рассмотрение данного гемотеста как потенциального метода оценки действия нейроцитопротекторов на примере кортексина.

В исследование были включены 120 мужчин и женщин с ИИ в возрасте от 18 до 70 лет, госпитализированные с подозрением на транзиторную ишемическую атаку (ТИА) или ИИ в течение до 72 ч от начала заболевания. Пациентов включали в исследование с января 2015 г. по июль 2016 г. У 36 пациентов на основании разрешения симптомов в течение 24 ч была диагностирована ТИА, у 84 — выявлена клиническая картина ИИ либо в каротидной системе (70 больных), либо в вертебрально-базилярной системе с синдромом Валленберга—Захарченко (14 больных). Группу контроля составили 20 здоровых.

В исследование не были включены пациенты с сопутствующими воспалительными, аутоиммунными, психическими, тяжелыми метаболическими и онкологическими заболеваниями, беременностью, а также пациенты с ИИ, которым по объективным причинам не удалось выполнить МРТ-исследование. Кроме того, были исключены пациенты, чьи образцы плазмы подверглись гемолизу.

У всех обследуемых был собран анамнез жизни и заболевания. Все пациенты с симптомами ИИ прошли общее клиническое и неврологическое обследования, включавшие результаты по шкале инсульта Национального Института Здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS) [14]. В течение 24 ч проводились КТ, МР-исследования головного мозга.

Протокол МР-исследования на аппарате Siemens 1.5 Tesla Avanto с возможностью эхопланарной визуализации включал следующие режимы сканирования: T1-, Т2-взвешенное изображение в сагиттальной и аксиальной проекциях, FLAIR в аксиальной проекции, DWI. Полученные изображения интерпретировались сертифицированным нейрорадиологом. Отмечались расположение и размер очага.

Объем инфаркта измеряли с помощью программного обеспечения Analyze software 6.1 (Biomedical Imaging Resource, Rochester, Minn). Очаг инфаркта в мм отмечался на аксиальной проекции, при мультифокальном поражении суммировались объемы всех очагов.

Всем пациентам была проведена адекватная терапия с учетом тяжести состояния и патогенетического подтипа И.И. Нейропротективная терапия осуществлялась посредством ежедневного внутримышечного введения препарата кортексин 20 мг/сут (10 мг утром и 10 мг днем) в течение 10 дней.

Анализ крови производился при поступлении в стационар и после проведения курса лечения кортексином. Венозную кровь объемом 5 мл собирали в вакуумированные пробирки с К2-ЭДТА. Плазму получали центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Образцы находились при температуре не выше +4 °C до центрифугирования. Процесс подготовки образцов занимал 30 мин с момента взятия крови для того, чтобы исключить разрушение NR2-пептида сериновыми протеазами. Плазму с признаками гемолиза при анализе не использовали из-за возможной кросс-реакции с гемоглобином. Готовые образцы плазмы хранили при температуре –40 °C.

Определение NR2 пептида в плазме. Анализ образцов проводился с помощью наборов Gold Dot Test (CIS Biotech, Inc., Atlanta, GA). Аликвоты образцов использовали однократно после размораживания [15]. Концентрация NR2-пептида измерялась методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением специфических аффинных очищенных антител к NR2-субъединицам глутаматных рецепторов и пероксидазой хрена (HRP) в качестве индикаторного фермента. Полученная смесь инкубировалась при +37 °C в течение 20 мин. Далее частицы осаждались с помощью магнита, а жидкая фаза удалялась. После промывки магнитных частиц буфером выявляли реакцию добавлением в лунки 100 мкл тетраметилбензидилового (ТМБ) субстрата. Развивающуюся цветную реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора кислоты после 10-минутной инкубации при +25°C. Регистрировали оптическую плотность раствора на микропланшетном спектрофотометре BioTek ELx800™ при длине волны 490/630 нм. Калибровочную кривую строили используя оптическую плотность калибраторов с известной концентрацией. С помощью полученной калибровочной кривой рассчитывали концентрацию NR2-петида в образцах крови. Коэффициент вариации внутри анализа составлял 5,3—6,3%, между анализами — 5,9—9,8%.

Исследование проводилось на основе клинического протокола, утвержденного локальным этическим комитетом Первого СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Всеми пациентами было подписано информированное согласие на проводимое исследование.

Статистический анализ осуществляли в обеих исследуемых группах с использованием общепринятых методов описательной статистики. Различия показателей оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при p<0,001. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена применялся для оценки корреляции между значениями NR2-пептида и объемом инфаркта головного мозга по данным МРТ.

В группе ИИ средний балл по шкале NIHSS при поступлении составлял 5,3. Клиническая картина зависела от пораженного сосудистого бассейна. У 2 пациентов с ТИА развился ИИ в течение 24 ч с момента поступления.

При проведении обследования у пациентов были выявлены такие этиологические факторы ИИ, как атеросклероз, гипертоническая болезнь, фибрилляция предсердий, аномалии строения кровоснабжающих мозг сосудов (часто гипоплазии и аплазии позвоночных артерий, задних соединительных артерий, патологическая извитость магистральных сосудов головы).

Результаты определения содержания NR2-пептида в плазме крови обследованных пациентов в виде усредненных значений без учета динамики, обусловленной проводимой нейропротективной терапией, представлены в таблице.

Данные значения NR2-пептида показывают, что его содержание в плазме больных с ИИ имело тенденцию к увеличению, особенно при локализации ишемического очага в области васкуляризации передних и средних мозговых артерий, что соответствует данным литературы [12, 14]. Данный показатель превышал аналогичный параметр в группе здоровых в 5—7 раз (p<0,0005).

Сравнение средних значений NR2-пептида показало значимое (p<0,0001) различие его концентрации в плазме между группой больных с ИИ в каротидной (среднее 10,6 нг/мл, диапазон 5,20—25,71 нг/мл) и вертебрально-базилярной системах (среднее 6,72 нг/мл, диапазон 2,91—18,35 нг/мл).

Размер инфаркта, по данным МРТ, варьировал от 20 до 100 мм. Корковые инсульты наблюдались в 43% случаев, подкорковые — в 57%. Концентрация NR2-пептида в плазме у пациентов с ИИ коррелировала с объемом подкорковых и корковых очагов (до 80 мм), выявленных при проведении МРТ головного мозга (rs=0,73) (рис. 1). Наибольшие значения отмечались в пределах 1—12 ч с момента появления клинических симптомов.

Как отмечалось выше, концентрация NR2-пептида в плазме крови исследовалась дважды: до и после проведенного курса нейропротективной терапии. Сравнение концентрации NR2-пептида у пациентов с ИИ до и после лечения кортексином показало снижение уровня маркера в среднем на 2,53 нг/мл (p<0,0001).

Со времени открытия биохимической структуры и описания физиологической роли рецепторов глутамата был проведен ряд исследований [12, 13, 16], подтвердивших диагностическую значимость NR2-подтипа NMDA-глутаматных рецепторов в определении прединсультных и инсультных состояний. По данным С.А. Дамбиновой и соавт. [16], у здоровых добровольцев концентрация NR2-пептида в сыворотке крови составляет в среднем 0,33 нг/мл (0,02—1,15 нг/мл). На основе полученных данных для NR2-пептидного гемотеста было предложено два пороговых значения: 0,5 и 1,0 нг/мл.

Проведенное исследование показало статистически значимое увеличение концентрации NR2-пептида при ИИ по сравнению с пациентами без ишемии мозга, что было подтверждено и в нашем исследовании. Умеренная корреляция наблюдалась между результатами пептидного гемотеста и размерами образовавшихся очагов инфаркта в коре головного мозга: 3,38 нг/мл при объеме очага до 10 мм и 25,73 нг/мл при очаге до 100 мм [16].

Отдельно под руководством проф. С.А. Дамбиновой проводились исследования по изучению патологических состояний, связанных с повышенным риском ИИ [17]. У пациентов с такими сосудистыми факторами риска, как сахарный диабет и артериальная гипертензия, также отмечался повышенный уровень NR2-пептида (1,54—2 нг/мл), что свидетельствовало о наличии микроциркуляторных нарушений.

Определение клинического значения пептидного гемотеста при пороговом значении 1,0 нг/мл показало, что при поступлении с подозрением на инсульт в первые 72 ч заболевания он может дифференцировать ИИ от других состояний. Чувствительность теста при этом составляет 92%, а специфичность — 96%, что демонстрирует в итоге его положительную прогностическую значимость на 93%. При отрицательных результатах анализа (<1,0 нг/мл) вероятность ИИ очень низка (около 4%). Возможность постановки диагноза ИИ до проведения дорогостоящей нейровизуализации позволит существенно сократить ненужные обследования и тем самым снизить финансовые затраты.

В плазме некоторых здоровых был обнаружен повышенный уровень NR2-пептида (1,10—1,15 нг/мл). Этот факт можно объяснить наличием хронических воспалительных заболеваний. NMDA-рецепторы могут быть вовлечены в процесс воспаления в связи с их расположением на поверхности микрососудов [10—12]. Аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка, ревматоидный артрит), нейроваскулиты, туберкулез, заболевания почек могут сопровождаться повышением уровня NR2-пептида. Известно описание анти-NMDA-рецепторного энцефалита [14]. В таких случаях, несмотря на имеющиеся существенные различия в клинической картине этих заболеваний и ИИ, потребуются дополнительные исследования, чтобы оценить значение ложноположительных анализов на NR2-пептид.

Возможные ограничения метода могут быть связаны с размерами и расположением очагов ишемии мозга. В предварительных исследованиях [16] удалось выявить корковые очаги размером 10—20 мм. Однако лакунарные подкорковые инсульты не всегда сопровождались повышением уровня NR2-пептида. По отношению к микроинфарктам чувствительность МРТ также ограничена. Поэтому требуется дальнейшее накопление фактов для установления корреляции между уровнем NR2-пептида в крови и размерами очага инфаркта мозга, изменениями мозговой перфузии, размерами пенумбры и их влиянием на уровень биомаркера в сопоставлении с данными современных методов нейровизуализации у пациентов в острейший период инсульта.

Одной из ключевых целей данного исследования было определение динамики NR2-пептида в плазме больных с ИИ в результате лечения низкомолекулярным нейроцитопротектором на примере кортексина. Повторный анализ плазмы крови пациентов выявил снижение NR2-пептида в среднем на 2,53 нг/мл после проведенного 10-дневного курса лечения препаратом.

Эффективность кортексина при сосудисто-мозговых заболеваниях ранее была доказана в ряде рандомизированных плацебо-контролируемых исследований [18, 19]. В настоящей работе это подтверждено не только регрессом клинических проявлений (средний балл по шкале NIHSS после курса лечения составил 2 при изначальном 5,3), но и динамикой биомаркера ишемии мозга.

Примером диагностической значимости рассматриваемого биомаркера и терапевтической эффективности препарата кортексин может служить следующее наблюдение. Пациент С., 56 лет, инженер-физик, поступил в клинику неврологии 12.04.15 с жалобами на периодическую головную боль распирающего характера, нарушение ясности зрения и затруднение в восприятии текста при чтении, снижение памяти на текущие события, поверхностный сон с частыми пробуждениями, общую слабость, боли в области сердца при физическом напряжении, эпизоды сердцебиений с нарушением ритма. На протяжении последних трех лет страдает сахарным диабетом 2-го типа с повышением уровня глюкозы в крови до 9,0 ммоль/л; артериальное давление колеблется от 130/85 до 160/90 мм рт.ст. По данным электрокардиограммы определяются ишемическая болезнь сердца, пароксизмы тахикардии и фибрилляции предсердий.

В неврологическом статусе выявлены умеренно выраженные нарушения когнитивных функций (по данным скринингового теста А.А. Скоромца и соавт. [20] и Монреальской шкалы оценки когнитивных функций — МоСА), правосторонний неглект-синдром, оживление глубоких рефлексов на правых конечностях, пятнистая гипестезия на правой половине туловища и ноге.

При МР-исследовании головного мозга выявлены очаги ишемического глиоза в глубинных отделах левой теменно-затылочной области, ишемия коры (рис. 2). На МР-ангиографии отмечены гипоплазия левой позвоночной артерии, отсутствие задних соединительных артерий (рис. 3).

Была диагностирована дисциркуляторная энцефалопатия 3-й стадии с перенесенным ОНМК по ишемическому типу (кардиоэмболический подтип) в системе ветвей левой средней мозговой артерии неизвестной давности на фоне атеросклеротического кардиосклероза с пароксизмами фибрилляции предсердий и сахарного диабета 2-го типа, гипертонической болезни III стадии.

Больному вводили кортексин по 20 мг внутримышечно ежедневно в течение 10 дней; после 5-дневного перерыва проведен курс лечения мексидолом по 5 мл внутримышечно ежедневно в течение 10 дней, затем по 1 таблетке 3 раза в день на протяжении 1 мес, кроме этого был назначен препарат ацетилсалициловой кислоты по 0,1 г в сутки, длительно. Спустя 2 нед больной выписан на амбулаторное лечение с рекомендацией коррекции углеводного обмена с помощью диеты и приемом глюкофажа. Трудоспособность была сохранена.

10.02.16 на фоне физического перенапряжения и пароксизма фибрилляции предсердий внезапно развились слабость и онемение правых конечностей, затруднение в произношении речи. Пациент госпитализирован в инсультный блок клиники неврологии.

В неврологическом статусе выявлены черты моторной афазии с выраженной дизартрией, глубокий правосторонний гемипарез (динамометрия правой кисти около 5 кг; левой кисти — 29 кг) с умеренным повышением мышечного тонуса по пирамидному типу, высокими глубокими рефлексами в правых конечностях с четкими патологическими кистевыми (Россолимо—Вендеровича) и стопными (Бабинского, Бехтерева) знаками, правосторонняя гемигипестезия, укорочение времени вибрационной чувствительности на правой лодыжке до 10 с (в норме 21 с).

МРТ головного мозга в диффузном режиме показала обширную ишемию левого полушария мозга. Концентрация NR2-пептида через 8 ч с момента дебюта симптоматики была равна 12,57 нг/мл. В стационаре проведено лечение кортексином по 20 мг в/м в течение 10 дней.

В клинической картине отмечено улучшение когнитивных функций, восстановилась речь, наросла мышечная сила в правой кисти до 15 кг, регрессировали проводниковые нарушения болевой чувствительности, вибрационное чувство удлинилось до 18 с. Бытовые навыки не нарушены.

При повторной МРТ отмечено значительное уменьшение зоны ишемии в левом полушарии головного мозга.

Концентрация NR2-пептида в сыворотке крови спустя 10 дней лечения кортексином была 8,31 нг/мл, т. е. снизилась на 4,26 нг/мл. Пациенту была подобрана адекватная медикаментозная терапия, направленная на вторичную профилактику инфаркта мозга.

Спустя 3 нед больного перевели в специализированный санаторий для курса нейро-реабилитационных мероприятий.

Результаты проведенного исследования показывают целесообразность и экономическую пользу внедрения в клиническую практику метода определения концентрации NR2-пептида в плазме крови как биомаркера ишемии мозга. При проведении курса лечения кортексином по 20 мг внутримышечно в течение 10 дней в остром периоде ИИ отмечено достоверное снижение концентрации данного маркера в плазме крови.

Тем не менее необходимо дальнейшее накопление фактов по динамике показателей этого теста под влиянием терапии острой и хронической сосудисто-мозговой недостаточности различными лекарственными препаратами и реабилитационными комплексами.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.