Геномная нестабильность в клетках головного мозга: хромосомный мозаицизм при шизофрении

Шизофрения — широко распространенное психическое заболевание с частотой около 1% в общей популяции. Согласно современным представлениям, его этиология и патогенез тесно связаны с генетическими факторами. Многие исследователи [1—8] отмечали значимую роль таких генетических факторов, как унаследованные от родителей и возникшие denovo генные и хромосомныемутации, редкие вариации числа копий ДНК размером более 1 тыс. пар нуклеотидов (CNV), редкие варианты мутаций одиночных нуклеотидов (SNV) и небольшие инсерции/делеции (indel), а также однонуклеотидные полиморфные варианты (SNP).

Современный взгляд на характер предрасположенности к шизофрении основывается на исследованиях, предполагающих, что различные типы мутаций и вариаций генома прямо или косвенно вовлекаются в ее патогенез и в совокупности могут объяснить до 20—30% риска возникновения этого генетически гетерогенного заболевания головного мозга [4—8]. Однако специфические генетические и эпигенетические факторы, влияющие на процесс взаимодействия генотипа с внешней средой и связанные с данным мультифакторным заболеванием психики, до настоящего времени не определены. Поэтому вопрос о роли приобретенных (т.е. постзиготических или соматических) мутаций и патогенных вариаций генома, регулирующих процессы развития и функционирования головного мозга в ходе онтогенеза в норме и при психической патологии, остается открытым [9—12].

Ранее нами [12—15] была высказана гипотеза о возможной связи хромосомной (геномной) нестабильности и соматических вариаций генома в клетках головного мозга с патогенезом шизофрении. Применение молекулярных и цитогенетических технологий в исследованиях последних лет предоставило убедительные данные о том, что хромосомная нестабильность проявляется в форме соматических вариаций генома в клетках разных тканей, включая головной мозг. Например, анеуплоидия в нервных клетках ведет к крупномасштабным геномным изменениям (Large-scale Somatic Genomic Alteration — LSGA), которые вовлекают сотни и даже тысячи генов и в большинстве случаев негативно влияют на развитие и функционирование головного мозга [12, 15]. После разработки молекулярно-цитогенетических методов появилась возможность оценить уровень геномной нестабильности в клетках головного мозга в норме и при патологии [16—18]. Анализ частоты хромосомных мутаций непосредственно в аутопсийных образцах головного мозга в норме показал, что, по оценкам разных авторов [15—18], приблизительно 10—30% нервных клеток являются анеуплоидными. Наличие мозаичной анеуплоидии было зафиксировано нами в ряде случаев в клетках головного мозга больных шизофренией [9, 10]. Эти эмпирические находки позволили предположить, что повышенный уровень численных аномалий хромосом в нервных клетках может являться характерным признаком пораженного мозга при шизофрении. По-видимому, нарушение гомеостаза нервных клеток в результате геномной нестабильности (мозаичной анеуплоидии) может привести к манифестации заболевания. Таким образом, определение роли геномной нестабильности в клетках мозга при шизофрении может быть ключом к пониманию молекулярных механизмов психических нарушений и их связи с наследственными и экзогенными факторами [14, 15, 19]. Однако крупномасштабные спонтанные вариации соматического генома в виде LSGA и наличие мозаичных клонов анеуплоидных клеток в мозге при шизофрении мало изучены [7, 10].

Цель настоящего исследования — проверка гипотезы о патогенной роли хромосомной (геномной) нестабильности при генетически обусловленных заболеваниях ЦНС на основе исследования уровня мозаичной анеуплоидии в клетках головного мозга индивидуумов без психической патологии и больных шизофренией.

В настоящем исследовании применялись современные молекулярно-цитогенетические методы, основанные на флюоресцентной гибридизации insitu с ДНК пробами на различные хромосомы (FISH), специально разработанные для анализа анеуплоидии в соматических клетках различных тканей человека, в том числе постмортальных клетках головного мозга [15—17]. Аутопсийные образцы замороженной ткани из префронтальной коры головного мозга [10] обрабатывали в соответствии с протоколом, который был подробно описан ранее [18]. Применяли интерфазную флюоресцентную многоцветовую гибридизацию insitu(интерфазная МFISH) c использованием количественной FISH (QFISH) на аутопсийных препаратах клеток головного мозга.

Был изучен аутопсийный материал 15 случаев шизо-френии и 15 контрольных образцов (норма).

Была использована оригинальная коллекция ДНК проб, описанная ранее [10, 16—18].

Препараты были пронумерованы и проанализированы в двойном слепом исследовании. Анализировали по 1000 клеток для каждой из шести пар исследованных хромосом 1, 9, 15, 16, 18, Х и Y, а также каждого исследованного образца головного мозга в норме и при шизофрении. Для каждой пары исследованных хромосом было проанализировано по 15 000 нервных клеток в контроле и при шизофрении. Всего было проанализировано по 90 000 клеток в контроле и при шизофрении. Значение p<0,05 считалось значимым (критерий Манна—Уитни, U-тест для независимых групп).

Методом MFISH с QFISH была оценена частота анеуплоидии с вовлечением различных хромосом в клетках постмортальных образцов мозга (кора головного мозга, поля Бродмана 10, 17 и 24) в контроле и при шизофрении. Применение метода МFISH с ДНК-пробами на хромосомы 1, 9, 15, 16, 18, Х и Y позволило нам определить относительную частоту анеуплоидных клеток головного мозга.

Анализ контрольных образцов показал, что частота анеуплоидии с вовлечением аутосом 1, 9, 15, 16, 18 варьировала в среднем от 0,31 до 0,46%, в то время как в случае половых хромосом эта величина составила 0,99% (табл. 1, А). Частота низкопроцентной анеуплоидии при 95% доверительном интервале варьировала в следующих пределах: 0,19—0,44% для хромосомы 1; 0,29—0,55% — 9; 0,26—0,61% — 15; 0,27—0,65% — 16; 0,25—0,71% — 18 и 0,60—1,38% — Х и Y (см. рисунок на цветной вклейке). Случаи низкопроцентного мозаицизма в контроле с частотой выше 2,5% в расчете на одну пару гомологичных хромосом в данном исследовании не обнаружены.

При шизофрении относительная частота анеуплоидии с вовлечением аутосом 1, 9, 15, 16, 18 варьировала в среднем от 1,09 до 2,73%; в случае половых хромосом эта величина составила 2,42 (табл. 1, Б). Частота низкопроцентной анеуплоидии при 95% доверительном интервале варьировала в следующих пределах: 0,62—2,33% для хромосомы 1; 0,53—1,75% — 9; 0,64—1,53% — 15; 0,48—1,68% — 16; 0,88—4,75% — 18 и 1,28—3,75% — Х и Y. Случаи низкопроцентного мозаицизма при шизофрении с частотой выше 2,5% были отмечены для аутосом 1 (2 случая), 9 (2), 16 (2), 18 (6) и половых хромосом Х и Y (6).

В результате проведенного исследования было установлено, что при шизофрении повышен уровень CIN, проявляющейся в виде мозаичной анеуплоидии как аутосом, так и половых хромосом (табл. 2). Анализ выборок по 15 000 клеток для каждой хромосомы во всех случаях контроля и при шизофрении выявил значительное увеличение частоты анеуплоидии для хромосом 1, 9, 15, 18 и половых хромосом Х и Y. Значения критерия Манна—Уитни, U-тест для независимых групп составили p<0,001, p<0,008, p<0,029, p<0,002 для аутосом 1, 9, 15, 18 соответственно и p<0,008 для половых хромосом Х и Y. В случае хромосомы 16 различий между контролем и шизофренией выявлено не было (p>0,269). Тем не менее анализ выборки 90 000 клеток в контроле и 90 000 0151 при шизофрении (группа хромосом 1, 9, 15, 16, 18, Х и Y) выявил 3-кратное увеличение средней частоты анеуплоидии в клетках мозга больных шизофренией от 0,54 до 1,64% (р=0,000013) значение критерия Манна—Уитни, U-тест для независимых групп).

Обнаружение соматического хромосомного мозаицизма в значительной степени затруднено ограничениями разрешающей способности многих методов анализа [1—7, 19—29]. Обычно применяемый цитогенетический анализ — один из наиболее простых и часто используемых методов, однако он ограничен метафазным анализом большого числа клеток для его выявления. Молекулярное кариотипирование с помощью array CGH является одним из наиболее высокоразрешающих методов выявления регулярных хромосомных микроперестроек, но позволяет обнаруживать мозаицизм в 20—30% клеток [14, 21, 22, 29]. Наличие клонов мозаичных клеток с более низкой частотой трудно оценить этим методом. Метод интерфазной FISH принято считать одним из самых подходящих для оценки межклеточных хромосомных изменений на уровне одной клетки при анализе огромного числа (сотни, тысячи и даже больше) интерфазных ядер [30, 31]. Тем не менее техника FISH зависит от возможных возникших артефактов, которые могут быть помехой в выявлении хромосомных делеций, дупликаций и других аномалий в клетке, включая анеуплоидию. Реальная частота низко-уровневой мозаичной анеуплоидии в соматических клетках трудно оценима по причине наложений и ассоциаций хромосом в интерфазном ядре, которые отражаются на числе FISH сигналов [18]. Чтобы избежать наличия возможных FISH артефактов как ложноположительных, так и ложноотрицательных, мы использовали несколько независимых подходов к выявлению аномалий хромосом: применение интерфазной МFISH и QFISH. Этот прием позволил определять анеуплоидию в клетках постмортального мозга, при этом стало возможным добиться высокого результата в обнаружении анеуплоидии на уровне единичных клеток. Таким образом, настоящая работа определила пороговый уровень для фоновой (спонтанная) анеуплоидии в головном мозге взрослого человека в норме, который составил около 2—2,5%. Более того, эти данные дают новые возможности для обнаружения аномальных вариантов уровня анеуплоидии, которые могут быть причиной нарушения функций мозга при различных заболеваниях.

Ранее репрезентативные исследования низкоуровневой мозаичной анеуплоидии при психической патологии в других тканях, помимо мозга (культивированные лимфоциты), были проведены для двух психических расстройств: аутизм и болезнь Альцгеймера (БА) [23—26]. Было показано [23], что у 19 (16%) из 116 детей с идиопатическим аутизмом в клетках крови наблюдается низко-уровневая мозаичная анеуплоидия хромосом Х, 9, 15 и 18. Существуют данные [24, 25], полученные обычным цитогенетическим методом с использованием культивированных лимфоцитов, о том, что частота клеток с трисомией хромосомы 21 увеличивается при Б.А. Целенаправленные исследования анеуплоидии с вовлечением хромосомы 21 при БА впервые с помощью FISH были проведены нами. Получены данные о том, что численный дисбаланс хромосом в нейронах головного мозга при БА может быть вовлечен в патогенез этого нейродегенеративного заболевания [25]. Анеуплоидии большинства хромосом являются редкими хромосомными аномалиями, порой несовместимыми с жизнью. Например, низкоуровневый мозаицизм в мозге по хромосоме 1 был ранее описан нами, но никогда не был зарегистрирован с помощью обычных цитогенетических методов в клетках крови у пациентов с шизофренией [10, 11]. Можно предположить, что, если данные относительного увеличения уровня анеуплоидии будут подтверждены на лимфоцитах у пациентов с шизофренией, то технология FISH, возможно, станет простым методом для лабораторной диагностики предрасположенности к данному заболеванию, как в случае с БА [25, 26].

Принято считать, что большая часть клеток во взрослом головном мозге сформирована из клеток предшественников нейронов и глии, образованных в основном в течение внутриутробного развития и первые годы жизни после рождения. Анеуплоидия в клетках головного мозга также, возможно, формируется во время раннего развития ЦНС. Исследование анеуплоидии в развивающемся мозге показало, что 30—35% всех нервных клеток были анеуплоидными [20]. Более того, было обнаружено, что мозаицизм клеточных линий с участием разных хромосом (низкий уровень мозаицизма) ограничен исключительно развивающимся мозгом [20]. Число анеуплоидных клеток сокращается в 3 раза на протяжении эмбриогенеза и приближается к 10% в нормальном мозге человека [13—15]. При этом выявленная хромосомная нестабильность в клетках эмбриона из-за «случайных» хромосомных мутаций является нормальным явлением в процессе онтогенеза. Однако некоторые нейрональные и глиальные ане-уплоидные клетки могут сохраняться в онтогенезе и остаться во взрослом мозге. Эти данные позволяют предположить, что хромосомная нестабильность, регистрируемая в сформировавшемся мозге человека, является продуктом раннего развития и, следовательно, наблюдается причинно-следственная связь с гипотезой о шизофрении и развитием нервной системы. Однако мы не можем полностью исключить, что нервные клетки могут образовываться в уже сформировавшемся головном мозге и анеуплоидизация является поздним явлением, связанным с его старением. Анеуплоидия соматических клеток может быть вызвана таким экологическим фактором, как экзогенное влияние мутагенов, вирусов, различных инфекций и, возможно, лекарственных препаратов. Кроме того, естественные процессы старения также могут привести к мозаичной анеуплоидии [31]. Однако предположение о том, что эти экзогенные факторы участвуют в патогенезе шизофрении, по-видимому, предварительно и нуждается в экспериментальной проверке. Следовательно, чтобы ответить на вопрос о роли генетических и экзогенных факторов в поддержании повышенного уровня мозаичной анеуплоидии в пораженном мозге, необходимы интенсивные исследования в нейрогеномике психических болезней в целом и шизофрении в частности.

Таким образом, гипотеза о возможной связи геномной нестабильности и шизофрении, предложенная ними ранее [12, 15], нашла экспериментальное подтверждение в данном исследовании. Свидетельства о повышенном уровне мозаичной анеуплоидии в пораженном мозге при шизофрении могут быть использованы в качестве основы для дальнейшего анализа роли генетической нестабильности, проявляющейся в виде анеуплоидии в головном мозге, при других психических заболеваниях, например аутизме. Можно предположить, что наличие повышенного уровня анеуплоидных нейронов в головном мозге с частотой выше, чем случайный фоновый уровень, может приводить к повышенной «генетической» нагрузке постзиготических CNV на нейрональный геном и негативно влиять на нормальное функционирование мозга [31—33].

Возможно, что при средней частоте спонтанной ане-уплоидии около 1,5% в расчете на хромосому интегральная величина низкопроцентной анеуплоидии в расчете на весь геном (т.е. 23 пары хромосом) составит 30—40%. Следовательно, мозаичная низкоуровневая анеуплоидия может являться неизвестной формой патогенных мозаичных LSGA. Кроме того, высокая частота спорадических хромосомных мутаций в головном мозге больных шизофренией позволяет обоснованно предположить, что низко-уровневая мозаичная анеуплоидия — это отличительная черта геномных нарушений при психической патологии. Свидетельства о геномной (хромосомная) нестабильности, проявляющейся в виде мозаичной анеуплоидии, позволяют подтвердить гипотезу о патогенной роли межклеточных геномных вариаций в пораженном мозге при шизофрении. Наконец, в перспективе, эти данные являются весомым аргументом для планирования исследовательских проектов с целью последующего анализа трудноуловимых геномных вариаций и изменений генома при других психических расстройствах на клеточном и молекулярном уровнях.

Исследование генетической нестабильности в постмортальных клетках головного мозга при психических заболеваниях (шизофрения и заболевания аутистического спектра) осуществлено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14−35−00060).

Исследование вариаций хромосом в контрольной группе частично выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14−15−00411).

Конфликтинтересовотсутствует.