Спинальная мышечная атрофия (СМА) - группа наследственных заболеваний, связанных с поражением мотонейронов передних рогов спинного мозга [1]. Это генетическая патология с наследованием по аутосомно-рецессивному типу, обусловленная в первую очередь мутациями в гене SMN1. Весомый вклад в модификацию патогенного фенотипа вносят и другие гены локуса 5q13: NAIP и Btf2-p44, а также микросателитный маркер C212 в гене H4F5 [2]. Ген SMN имеет две копии: тело- (SMN1) и центромерную (SMN2). Высокая нуклеотидная гомология между ними обусловливает выраженную генетическую нестабильность критического участка хромосомы 5ql3 и нарушение нормальных механизмов кроссинговера, результатом чего является образование гамет, в которых ген SMN1 утрачен или замещен его центромерной копией SMN2 [3-5].

Установлено, что 90-95% пациентов со СМА имеют гомозиготную делецию 7-го экзона SMN1 (из них 60-70% - еще и 8-го экзона); 2-5% - гетерозиготную делецию 7-го экзона SMN1 в компаунде с какой-либо точечной мутацией и менее 5% - мутацию c.873C>T, что приводит к превращению гена SMN1 в SMN2. Увеличение количества копий гена SMN2 способно частично компенсировать нехватку белка SMN, приводя к смягчению течения заболевания (типы II-III). Показано, что у больных с наиболее «мягким» фенотипом - болезнью Кугельберга-Веландера (СМА типа III) - число копий гена SMN2 составляет в среднем 4, тогда как при тяжелом типе I (болезнь Верднига-Гофмана) - обычно не превышает 1-2 [6, 7]. Белок SMN, синтез которого контролируется геном SMN1, играет важную роль в метаболизме нервных клеток, особенно биогенезе малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNPs), транскрипции и сплайсинге пре-мРНК, аксональном транспорте мРНК, формировании нервно-мышечных синапсов и миофибриллогенезе [8, 9].

В 2003 г. появились сообщения [10, 11] о специфических изменениях в процессе созревания РНК мутантного белка SMN1 под влиянием вальпроевой кислоты (противоэпилептический препарат). Кроме того, вальпроевая кислота является специфическим ингибитором деацетилаз гистонов, которые функционируют как универсальные регуляторы компактизации хроматина и экспрессии генов.

Однако до настоящего времени отсутствует единое мнение об эффективности вальпроевой кислоты в фармакотерапии пациентов со СМА. В частности, в экспериментах in vitro на культурах клеток больных СМА [11], животных моделях заболевания [12] и у отдельных больных [13] было выявлено позитивное действие вальпроевой кислоты. В дальнейших исследованиях улучшение функциональных показателей у больных СМА типа III установлено не было [14, 15], но оно отмечалось при СМА типа II [16]. На мышиной модели СМА типа I было выявлено негативное влияние вальпроевой кислоты на спинальные мотонейроны [17]. Многими исследователями при терапии вальпроевой кислотой была отмечена выраженная вариабельность уровня продукции как функционально полноценного белка SMN, так и его вариантов с делецией 7-го экзона [18-20].

Цель работы - изучение влияния вальпроевой кислоты на уровень белка SMN в мононуклеарах периферической крови в украинской популяции больных СМА и поиск возможных предикторов эффективности терапии.

В исследование были включены дети с молекулярно-генетически верифицированным диагнозом СМА (1-я группа) и их родители в качестве гетерозиготных носителей мутации (2-я группа). 1-ю группу составили 10 детей в возрасте от 1 года до 11 лет (3 мальчика и 7 девочек) и один взрослый (40 лет) пациент. У взрослого пациента имела место СМА типа III, у годовалого пациента - тяжелый тип I СМА. Остальные 9 детей имели промежуточный тип II СМА. Во 2-ю группу вошли по одному родителю 6 пробандов (6 человек).

У СМА больных 1-й группы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени устанавливали число копий гена SMN2. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови было выполнено с помощью набора реактивов ДНК-СОРБ-А (СИНТОЛ, Россия) по протоколу производителя. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе Corbett Rotor Gene («Qiagen»). Определение числа копий гена SMN2 проводили методом ""Ct с использованием референсной последовательности гена альбумина.

Для всех исследуемых групп методом твердофазного «сендвич»-варианта иммуноферментного анализа на микропланшетном анализаторе GBG Stat Fax 2100 (США) измеряли уровни SMN и β2-микроглобулина до и после приема вальпроевой кислоты в мононуклеарах периферической крови. Использовали ИФА-наборы SMN ELISA kit («Enzo», США) и Beta-2-Microglobulin (DRG, США). Мононуклеары периферической крови выделяли на фикол-урографин градиенте (плотность 1,077 г/мл) центрифугированием и затем лизировали согласно протоколу определения белка SMN в присутствии протеазных ингибиторов. Рассчитывали концентрации SMN и β2-микроглобулина (β2-MG) на количество мононуклеаров в 1 мл пробы, а также выражали уровень SMN на концентрацию β2-MG. Последний показатель содержал внутренний стандарт концентрации белка (β2-микроглобулин), поскольку в ответ на терапию вальпроевой кислотой наблюдается индукция синтеза белка у больных СМА в различной степени.

Длительность приема вальпроевой кислоты больными 1-й группы в среднем составила 15±5 сут, доза препарата была 20 мг/кг/сут.

Статистическую обработку данных проводили, рассчитывая достоверность различий между группами с помощью t-критерия Стьюдента и коэффициент корреляции Спирмена. Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез считали p<0,05.

Установили, что больные с типами I и III СМА имели две и три копии гена SMN2 соответственно. Для остальных детей с типом II спинальной мышечной атрофии выявили две копии гена SMN2 у 1 пробанда, три - у 7 и четыре - у 1. Таким образом, значимой статистической корреляции между числом копий гена SMN2 и фенотипами СМА в небольшой исследуемой выборке выявить не удалось (p=0,60). Также не наблюдалось корреляции между количеством копий гена SMN2 и уровнем белка SMN в мононуклеарах периферической крови (p=0,28) или индукцией синтеза этого белка в ответ на прием вальпроевой кислоты (p=0,35). Единственно достоверным фактом в 1-й группе оказалось увеличение в 2,4 раза концентрации белка SMN в мононуклеарах периферической крови после фармакотерапии вальпроевой кислотой (см. таблицу).

Известно, что 80% транскриптов гена SMN2 являются функционально неполноценными в результате потери 7-го экзона, и только в некоторых случаях при сверхэкс­прессии ядерных белков сплайсомного комплекса созревают функционально полноценные транскрипты [21]. Ранее было показано [9], что вальпроевая кислота, воздействуя непосредственно на ядерные белки и рибонуклеопротеиды сплайсомного комплекса 7-го экзона, в частности фактор сплайсинга Htra2-β1, способствует сохранению этого экзона 7 в первичном РНК транскрипте и приводит к увеличению концентрации SMN. Увеличение этого белкового продукта под влиянием вальпроевой кислоты отмечено в опытах in vitro на культурах клеток больных СМА и у гетерозиготных носителей мутантного SMN1 [9, 10].

В нашем исследовании повышение концентрации белка SMN у пациентов с различными типами СМА после 2-недельного приема вальпроевой кислоты продемонстрировано in vivo. Мы предполагаем, что это отражает комплексное действие двух процессов - неспецифической активации биосинтеза белка в результате ингибирования вальпроатом деацетилаз гистонов, в результате чего возрастает общий пул синтезированного de novo белка SMN, в том числе и полноразмерного; специфического взаимодействия этого препарата с фактором сплайсинга Htra2-β1с увеличением доли полноценного белка SMN в общем пуле.

Кроме того, у пациентов с тремя копиями SMN2 и типом II СМА низкий уровень белка SMN коррелировал с малой индукцией его синтеза в ответ на прием вальпроевой кислоты (p=0,92). Это оказалось достаточно специфичным эффектом только для внутриклеточной концентрации белка SMN, тогда как для содержания β2-микроглобулина аналогичной силы корреляция не выявлена (p=0,15). Мы предполагаем, что это связано с проблемами взаимодействия вальпроевой кислоты со сплайсомным комплексом 7-го экзона гена SMN2 у этих больных.

При сравнительном анализе относительного показателя SMN/β2-MG в семьях пробандов (1-я и 2-я группы) была обнаружена устойчивая корреляция значений этого показателя внутри каждой семьи (см. рисунок): p=0,97.

Таким образом, предсказать последствия фармакотерапии вальпроевой кислотой на основе информации о количестве копий гена SMN2 или фенотипа СМА у больных СМА не представляется возможным, поскольку в механизм действия этого препарата вовлечены как специфические, так и неспецифические процессы, детерминированные индивидуальным генотипом пробанда. В случае возраста больного до 2 лет, когда риск нежелательных явлений при применении вальпроевой кислоты наиболее высок, можно предложить короткий тест-курс родителям - носителям мутантного гена SMN1 и на основании полученных результатов о степени увеличения уровня белка SMN принимать решение о целесообразности данной терапии у ребенка со СМА.

Работа выполнена при поддержке Харьковского благотворительного фонда «Дети со СМА» (президент В.Н. Матюшенко).