Согласно современным представлениям [1-5], в патогенезе алкогольной зависимости большую роль играет ГАМКергическая система мозга. Считают, что в основе эффекта алкоголя лежит потенциация ингибиторного эффекта ГАМК, при этом ГАМКА-рецепторы, являясь мишенями для алкоголя, занимают центральное место в опосредовании его действия. Этим представлениям соответствуют данные о снижении ГАМКергической нейротрансмиссии у больных алкоголизмом и лиц с высоким риском развития алкогольной зависимости [2, 6].

При рассмотрении роли ГАМКА-рецепторного комплекса при алкоголизме необходимо учитывать, что на ГАМКА-рецепторе имеются места связывания для различных эндо- и экзогенных веществ, способных модулировать его активность. К таким веществам относятся этанол и бензодиазепины. Последние, связываясь со специфическими местами - бензодиазепиновыми рецепторами (БДР) на ГАМКА-рецепторе, образуют ГАМКА-бензо­диа­зепи­новый рецепторный комплекс [7]. Установлено, что его функцию может существенным образом изменять хроническое употребление алкоголя. По мнению многих исследователей [4, 8-10], потенциация ингибиторного эффекта ГАМК лежит в основе седативного и ингибиторного эффектов бензодиазепинов и алкоголя. К сказанному выше можно добавить, что БДР в отличие от других рецепторов (например, опиатные) не имеют установленных эндогенных лигандов.

Роль БДР как в норме, так и при развитии патологических процессов в ЦНС остается не до конца изученной. Это определяет актуальность исследования бензодиазепиновой рецепторной системы при хроническом действии алкоголя и уточнения ее значения в патогенезе алкогольной аддикции.

Настоящая работа является частью проводимого в НИИ психического здоровья Сибирского отделеления РАМН исследования по изучению роли БДР в патогенезе алкоголизма. Ранее были опубликованы результаты исследования периферических БДР тромбоцитов у больных алкоголизмом [11, 12] и формирования БДР в процессе синаптогенеза в условиях пренатальной алкоголизации [13].

Цель настоящего исследования - изучение бензодиазепиновой рецепторной системы мозга человека и крысы в норме и при хронической алкоголизации.

Исследование было проведено на аутопсийном мозге человека и мозге крыс при экспериментальном алкоголизме.

Образцы мозга человека были получены при проведении ранних анатомических вскрытий (не позднее 6 ч после наступления смерти) в 21 случае смерти страдавших алкоголизмом мужчин 33-54 лет (основная группа). Контрольная группа состояла из 21 человека, не имевших при жизни неврологических и психических заболеваний. При патологоанатомической диагностике учитывали данные анамнеза, клинические проявления болезни, включая соматические (состояние печени и др.)

Образцы мозга замораживали и хранили до исследования в жидком азоте. Выделяли участки префронтальной коры мозга, коры мозжечка и головки хвостатого ядра мозга.

Методической основой изучения роли бензодиазепиновой рецепторной системы мозга крыс в формировании предпочтения алкоголя и развитии алкоголизма послужила модель, разработанная Ю.В. Буровым и соавт. (1984) в НИИ фармакологии РАМН (Москва) [14], в которой используется влияние мета-хлор-бензагидрилмочевины (м-хБГМ) на уровень потребления 15% раствора алкоголя крысами. Эту методику использовали в нашей модификации.^[1] Эксперименты проведены на 250 крысах-самцах линии Вистар массой 150-200 г. м-хБГМ вводили крысам в течение 14 дней в дозе 100 мг/кг в виде суспензии 1% крахмальной слизи с помощью зонда с оливой из расчета 1 мл суспензии на 100 г массы животного. Выбор дозы 100 мг/кг соответствует 1/20 LD50 м-хБГМ, что максимально приближено к терапевтическому диапазону доз.

По окончании экспериментального периода крысы по потреблению 15% алкоголя и воды были разделены на следующие основные группы: «многопьющие» (1-я), «малопьющие» (2-я) и «непредпочитающие» (3-я) алкоголь.

В дальнейшем была выделена 4-я группа - «многопьющие» крысы, которым вводили м-хБГМ.

Для проведения радиорецепторного анализа (РРА) свойств БДР в коре головного мозга в различных группах по окончании экспериментального периода крыс декапитировали, мозг извлекали, кору отделяли, замораживали и хранили в жидком азоте.

Разделение ткани образцов головного мозга человека и крысы на фракции мембран синаптосом и митохондрий проводили с помощью препаративного ультрацентрифугирования в нашей модификации. Полученные фракции мембран замораживали и хранили при t= –80 °С. Исследование свойств БДР проводили методом РРА путем связывания синаптосомальных и митохондриальных мембран с селективными лигандами.

Связывание [³Н]флунитразепама с мембранами синаптосомальной фракции ткани мозга человека и крысы. Свойства синаптосомальных БДР коры мозга крысы и ауто­псийного материала мозга человека исследовали методом РРА путем связывания [³Н]флунитразепама (85 Ки/ммоль, «Амершам», Англия) с мембранами синаптосомальной фракции ткани мозга при t=0 °С 60 мин. Концентрации лиганда составили 0,2-15 нМ. Концентрация мембран по белку составила 0,2 мг/мл в 0,25 мл инкубационной пробы. Неспецифическое связывание проводили с флунитразепамом в концентрации 10 мкМ.

Связывание [³Н]PK-11195 с мембранами митохондриальной фракции ткани мозга человека. В этом случае при РРА проводили связывание [³Н]PK-11195 (85,5 Ки/ммоль, NEN, США) (0,2-15 нМ) с мембранами при t=0 °С 90 мин. Кон­центрация мембран по белку составила 0,2 мг/мл в 0,25 мл инкубационной пробы. Неспецифическое связывание проводили с РК-11195 в концентрации 10 мкМ.

Связывание [³Н]Ro5-4864 с МСС мембранами митохондриальной фракции коры мозга крысы. РРА связывания [³Н]Ro5-4864 (90 Ки/ммоль, NEN, США) (0,2-25,0 нМ) с мембранами проводили при t=0 °С в течение 120 мин. Концентрация мембран по белку составила 0,6 мг/мл в 0,25 мл инкубационной пробы. Неспецифическое связывание проводили с Ro5-4864 в концентрации 10 мкМ.

Связанный лиганд во всех случаях отделяли фильтрацией через GF/B фильтры («Whatman», Англия) вакуумной фильтрацией с использованием системы HARVESTER- SKATRON (США) в 15 мл Трис-НСl (50 мМ, рН=7,4, при t=0°С). Радиоактивный анализ количества связанного лиганда проводили в сцинтилляционном счетчике Rack-beta (LKB). Константу диссоциации (Кд) и максимальное число (плотность) мест специфического связывания (Вмакс) определяли методом анализа кривых насыщения в координатах Скэтчарда.

Распределение признаков достоверно не отличалось от нормального, поэтому для статистической обработки данных применяли параметрический метод вариационной статистики (критерий Стьюдента) с использованием программы Statistika 8.0, различия считали значимыми при p<0,05.

Экспериментальная работа проводилась в лаборатории нейробиологии НИИ психического здоровья СО РАМН (Томск) и лаборатории клинической биохимии Научного центра психического здоровья РАМН (Москва).

Изучение характеристик связывания селективного лиганда [³H]флунитразепама с мембранами синаптосомальной фракции показало, что их свойства в исследованных структурах различаются. Наибольшая аффинность рецепторов была выявлена в хвостатом ядре, менее аффинными оказались рецепторы коры головного мозга (область префронтальной коры) и коры мозжечка. Плотность рецепторов в исследуемых структурах мозга также отличалась - максимальная плотность рецепторов (Вмакс) была выявлена в хвостатом ядре и префронтальной коре головного мозга. В коре мозжечка плотность рецепторов была значительно ниже (табл. 1).

Полученные данные свидетельствуют о снижении аффинности синаптосомальных БДР в различных структурах головного мозга больных алкоголизмом. Bмакс оказалась достоверно повышенной. Следует отметить разную степень выраженности обнаруженных изменений. Плотность синаптосомальных БДР была значительно выше в коре головного мозга, хвостатом ядре, в меньшей степени - в коре мозжечка. Выявленные нами изменения свидетельствуют о снижении аффинности синаптосомальных БДР в мозге человека под влиянием хронической алкоголизации и повышением их плотности по сравнению с контролем с разной степенью выраженности этих изменений в отдельных структурах.

Изучение характеристик связывания селективного лиганда [³H]РК-11195 с митохондриальной фракцией мембран мозга человека показало, что наиболее аффинны митохондриальные БДР хвостатого ядра, менее - рецепторы коры мозга и коры мозжечка. Их максимальная плотность была выявлена в префронтальной коре головного мозга, меньшее количество - в коре мозжечка и хвостатом ядре (табл. 2).

Наибольшие изменения БДР по сравнению с контролем были выявлены в хвостатом ядре и коре мозжечка.

Полученные результаты свидетельствуют о неоднородном изменении свойств БДР (аффинность и число мест связывания) селективных лигандов в мозге человека под влиянием хронической алкоголизации, что соответствует представлениям о пластичности рецепторов и возможности их гетерогенной физиологической реакции в разных областях мозга на разные воздействия, в том числе на этанол.

Было установлено, что cродство синаптосомальных рецепторов к [³Н]флунитразепаму (1/Kd) достоверно снижено в 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й. Это дает основание предположить наличие изначально сниженной аффинности синаптосомальных БДР в коре мозга крыс, предпочитавших этанол по сравнению с животными, отвергавшими его. Во всех обследованных группах животных значимых различий по Вмакс выявлено не было. Однако можно отметить возрастание плотности рецепторов у крыс 1-й и 2-й групп по сравнению с 3-й (табл. 3).

Увеличение числа мест связывания [³Н]флунитразепама в мозге крыс в 1-й и 2-й группах может носить компенсаторный характер в условиях дефицита ГАМКергической функции в связи со снижением сродства БДР. При сравнении параметров связывания [³Н]флунитразепама с синаптосомальными мембранами коры мозга крыс (1-й и 2-й групп) следует отметить, что они близки между собой по значениям (см. табл. 3). Таким образом, свойства синаптосомальных БДР крыс в 1-й и 2-й группах, находившихся весь экспериментальный период в разных условиях, отличались от свойств рецепторов коры крыс, не выявивших алкогольную мотивацию. Снижение аффинности БДР, модулирующих функцию ГАМКАР, у крыс, предпочитавших этанол, свидетельствует об изменении ГАМК­ергической нейромедиации, процессов торможения в коре мозга животных, что может стимулировать потребление алкоголя как субстрата, оказывающего стимуляцию ГАМК-медиации. Эти нейропластические изменения могут привести к развитию выраженной алкогольной мотивации и формированию алкогольной зависимости.

Введение м-хБГМ в течение 14 дней (100 мг/кг/сут) «многопьющим» крысам (4-я группа) вызывает повышение аффинности связывания [³Н]флунитразепама - снижает значения Кд, но не достигает значений Кд в группе у крыс, отвергавших этанол. Значения Кд у крыс 4-й группы оказались сравнимы с таковыми у крыс 2-й группы. Следовательно, м-хБГМ увеличивает сродство синаптосомальных БДР к агонистам, повышая таким образом нейромедиацию ГАМК в коре головного мозга крыс. Введение м-хБГМ «многопьющим» крысам вызывало снижение Вмакс; значения Bмакс были сравнимы с таковыми в 3-й группе. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Возможно, улучшение нейромедиации ГАМК за счет повышения аффинности БДР приводит к снижению экспрессии рецепторов, носившей компенсаторный характер. Введение м-хБГМ вызывало резкое снижение потреб­ления этанола у крыс при свободном доступе к 15% этанолу, начиная со 2-3-го дня его применения, сохраняя этот уровень потребления в течение 14 дней наблюдения. м-хБГМ вызывает изменение свойств синаптосомальных БДР коры мозга у крыс, предпочитавших алкоголь и длительно находившихся под его воздействием, повышая аффинитет рецепторов к агонистам и несколько снижая их плотность.

Исследование свойств митохондриальных БДР, не сопряженных с ГАМКА-рецепторами, изучали с использованием селективного лиганда [³Н]Rо 5-4864 (см. табл. 4).

Анализ полученных данных показал статистически значимое увеличение мест связывания [³Н]Ro5-4864 (Вмакс) в митохондриальной фракции мембран коры мозга крыс 1-й и 2-й групп по сравнению с 3-й группой на 54,8-59,4% соответственно. Увеличение (до 60%) плотности митохондриальных БДР головного мозга крыс, предпочитавших алкоголь, связано с одновременным снижением сродства рецепторов (1/Кд). Было выявлено увеличение значений Кд в 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й, что свидетельствует о снижении аффинности исследуемых БДР, причем выраженность этих изменений у «мало-» и «многопьющих» крыс оказалась различной. Таким образом, нами установлено, что как у «много-», так и «малопьющих» крыс повышены значения Кд по сравнению с непредпочитающими этанол животными, что свидетельствует о значительном снижении аффинности митохондриальных БДР в коре головного мозга крыс, предпочитавших алкоголь.

Сравнительное исследование свойств митохондриальных БДР у крыс, предпочитавших этанол, но по условиям эксперимента составивших разные группы (1-я и 2-я группы), показало, что аффинность рецепторов (1/Kд) у «многопьющих» крыс оказалась достоверно ниже аффинности рецепторов в коре мозга у «малопьющих» животных. Длительное воздействие алкоголя приводило к более выраженному снижению их аффинности (>2 раза). Плотность митохондриальных БДР (Вмакс) у «малопьющих» крыс оказалась сравнимой с таковой у «многопьющих». Плотность их в коре мозга крыс, предпочитавших алкоголь, в обеих группах была достоверно значительно выше, чем у крыс 3-й группы. Значения плотности митохондриальных БДР в коре мозга у крыс в этих группах различались почти в 2 раза. Уровень плотности митохондриальных рецепторов - наиболее чувствительный индекс повреждения нервной ткани, в особенности глиальных клеток.

Введение м-хБГМ в течение 14 дней в дозе 100 мг/кг массы тела «многопьющим» крысам, длительно подвергавшимся воздействию этанола (4-я группа), вызывало снижение Кд по сравнению с соответствующими значениями этого показателя у «многопьющих» крыс, не получавших м-хБГМ (1-я группа). Это свидетельствует о повышении аффинности связывания [³Н]Ro 5-4864 с митохондриальными рецепторами в коре мозга «многопьющих» крыс под влиянием м-хБГМ. Было выявлено также достоверное снижение плотности связывания [³Н]Ro 5-4864 (Вмакс) в мозге крыс 4-й группы по сравнению с 1-й. Показатели связывания [³Н]Ro 5-4864 с БДР в мозге «многопьющих» крыс на фоне 14-дневного введения м-хБГМ «улучшались», но не достигали значений соответствующих показателей у крыс в контрольной группе. Количество мест связывания [³Н]Ro 5-4864 (Вмакс) в 4-й группе было сравнимо с их количеством в 3-й группе, тогда как значения Кд достоверно различались.

Полученные данные свидетельствуют, что м-хБГМ вызывает повышение аффинности митохондриальных БДР и снижение плотности рецепторов у крыс 1-й группы. Следовательно, 14-дневное введение м-хБГМ (100 мг/кг/сут) «многопьющим» крысам, предпочитавшим этанол и подверженным длительному (в течение 10 мес) влиянию алкоголя, оказывает «нормализующее» влияние на показатели связывания селективного лиганда [³Н]Ro 5-4864 с местами специфического связывания на мембранах митохондриальной фракции коры головного мозга.

Одной из ведущих гипотез, принятых в настоящее время, является гипотеза развития толерантности к этанолу за счет усиления действия ГАМК, которой соответствуют предположения о том, что генетическая нечувствительность к этанолу может быть обусловлена сниженной чувствительностью к ГАМК и ГАМК-модуляторам. В настоящем исследовании были получены данные, подкреп­ляющие представления о биологической детерминированности свойств БДР в коре головного мозга крыс с различным предпочтением к этанолу и однонаправленном изменении их под влиянием хронической алкоголизации. Влияние курсового применения антиконвульсанта м-хБГМ приводит к изменению свойств БДР мозга как синаптосомальных, так и митохондриальных, причем в большей степени отмечено влияние на БДР михотондриальной локализации, связанное с энергетическими процессами в нейронах и клетках глии.

Полученные нами данные свидетельствуют о выраженном влиянии алкоголя на свойства БДР головного мозга, причем соответствующие изменения могут носить адаптивный характер. Они подтверждают также существование регуляторных механизмов на рецепторном уровне. Кроме того, данные, относящиеся к действию антиконвульсанта м-хБГМ, способного снижать потреб­ление алкоголя животными при экспериментальном алкоголизме, позволяют предположить возможность использования новых антиконвульсантов, обладающих модулирующим действием на нейромедиаторные процессы, для лечения алкогольной зависимости.