Оценка уровня железа в мозговой ткани в контексте диагностики хронической алкогольной интоксикации

Посмертная диагностика хронической алкогольной интоксикации при отсутствии анамнестических данных в большинстве случаев является непростой задачей для судебно-медицинских экспертов. Решению указанной задачи посвящен ряд опубликованных в последнее десятилетие научных работ отечественных исследователей [1—4].

Избыточное депонирование железа может индуцировать перекисное окисление и разрушение клеточных мембран и приводить к апоптозу. Вместе с тем в настоящее время нет единого мнения о первичном или вторичном характере повышения уровня железа в ткани головного мозга при нейродегенеративных заболеваниях [5].

В то же время для этой группы патологий визуализация на снимках магнитно-резонансной томографии (МРТ) накопления железа в разных участках головного мозга позволяет лучше определить стадию и тяжесть заболевания [6, 7]. Помимо нейродегенеративных заболеваний, нарушение депонирования железа в головном мозге наблюдается и у лиц, злоупотребляющих алкоголем. При длительном употреблении алкоголя повышается проницаемость стенки кишечника, что ведет к повышенной абсорбции железа энтероцитами; в печени алкоголь ингибирует синтез гепцидина — гормоноподобного вещества-регулятора распределения железа [8].

M. Juhás и соавт. (2017) в исследовании распределения депозитов железа в головном мозге у лиц, злоупотребляющих алкоголем, по данным функциональной МРТ сравнивали хвостатое ядро, скорлупу и бледный шар (вместе), черное вещество и красное ядро (вместе), зубчатое ядро и эталонную область белого вещества во внутренней капсуле; более интенсивное депонирование железа у лиц, злоупотребляющих алкоголем, выявили в хвостатом ядре, скорлупе и бледном шаре и в зубчатом ядре [9]. В результате проведенного A. Topiwala и соавт. (2022) крупнейшего на сегодняшний день исследовании связи потребления алкоголя и гомеостаза железа (выборка составила 20 729 участников) установлено, что у лиц, потребляющих алкоголь (7 стандартных доз = 56 г в неделю и больше), более интенсивное накопление железа при МРТ определялось в скорлупе, хвостатом ядре и черном веществе (сравнивали скорлупу, хвостатое ядро, гиппокамп, таламус и черное вещество); накопление железа у исследуемых было связано со снижением когнитивных функций [10]. Таким образом, прижизненные исследования с применением лучевых методов демонстрируют потенциал выявления областей депонирования железа в головном мозге для диагностики хронического злоупотребления алкоголем, его тяжести и метаболических предпосылок клинической симптоматики.

Для исследования уровня железа в посмертных образцах головного мозга могут быть использованы как лучевые методы исследования (МРТ), так и гистологические (окраска по Perls’ или Turnbull + DAB) и физические (спектрометрия с количественной оценкой), каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, а какой-либо «золотой стандарт» таких исследований на сегодняшний день отсутствует [11]. Кроме того, представленные работы не затрагивают такие важные судебно-медицинские аспекты, как сочетание нарушений обмена железа, связанных со злоупотреблением алкоголем, с черепно-мозговыми травмами разной давности, нетравматическими внутричерепными кровоизлияниями, иной органической патологией и нейродегенеративными заболеваниями, а также патоморфологические изменения метаболизма железа у лиц, злоупотреблявших наркотиками.

Цель исследования — оценить возможность посмертной диагностики хронической алкогольной интоксикации по данным содержания железа и его концентрации в структурах головного мозга.

Материалом исследования стали образцы ткани головного мозга — базальные ганглии слева и справа, черное вещество среднего мозга, гиппокамп. Всего было исследовано 80 образцов головного мозга от 20 лиц, умерших от травм, заболеваний и отравлений, в том числе от 4 женщин и 16 мужчин. Возрастной диапазон составил 16—96 лет. Посмертный интервал взятия биологического материала составил до 1 сут. Головной мозг исследовали с помощью поперечных разрезов от лобных долей к затылочным, с расстоянием между ними не более 2 см, ствол — не более 0,5 см. Вырезку образцов головного мозга для спектрального исследования производили в соответствии со схемой, представленной на рисунке на цв. вклейке, непосредственно во время секционного исследования отдельным чистым медицинским инструментарием с заводской заточкой. Перед использованием режущие кромки инструментов последовательно протирали ватными тампонами, смоченными дистиллированной водой и 95% этиловым спиртом. Полученные фрагменты (размером не более 0,5×0,5×0,5 см) промывали в индивидуальных флаконах 5—10 мл 0,9% раствора NaCl до удаления крови, после чего фрагменты в чистых сухих маркированных флаконах направляли на спектральное исследование.

Схема вырезки образцов головного мозга для спектрального исследования.

Исследование изъятых биологических объектов с целью установления концентрации железа производили посредством оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой. От каждого из образцов головного мозга с помощью аналогичных медицинских инструментов из срединной области отбирали несколько фрагментов общей массой примерно 1 г. Навески помещали в специальные тефлоновые сосуды и подвергали их кислотному разложению. В каждый сосуд добавляли 10 мл азотной кислоты (концентрированная, ОСЧ). Разложение проводили в микроволновой системе MARS (Interanalit Inc., Канада) в течение 15 мин по методике, рекомендованной фирмой-производителем. Перед измерением все образцы разбавляли в 2 раза деионизованной водой. Одновременно ставили пробу на чистоту реактивов.

Анализ выполняли с использованием эмиссионно-оптического спектрометра с индуктивно связанной плазмой модели ICP 730-ES (Varian, Австралия) при следующих условиях: мощность разряда — 1,0 кВт, расход плазмообразующего газа (аргон) — 15 л/мин, скорость аксиального потока аргона — 1,50 л/мин, поток аргона на распыление — 0,75 л/мин, время интегрирования сигнала — 1 с. Калибровку прибора проводили по стандартным растворам с точно известной концентрацией элементов. Концентрация железа (Fe) в стандартном растворе №1 составляла 0,01 мг/л, в стандартном растворе №2 — 0,1 мг/л, в стандартном растворе №3 — 1,0 мг/л, в стандартном растворе №4 — 10,0 мг/л.

Измерение проводили на двух наиболее чувствительных длинах волн элемента железа. Полученные значения концентраций усредняли. Количественное содержание железа приведено далее в пересчете на массу образца и с учетом разбавления. Среднее квадратичное отклонение (RSD) не превышало 5%.

Данные о концентрации железа в черном веществе и базальных ганглиях взвешивали по уровню концентрации железа в гиппокампе с целью приведения к общей шкале. Полученные результаты сопоставляли с возрастными характеристиками умерших, причинами смерти, результатами определения этанола и наркотиков в крови, наличием морфологических признаков хронической алкогольной и наркотической интоксикации, а также с наличием черепно-мозговых травм, нетравматическими внутричерепными кровоизлияниями, органической патологией головного мозга.

Статистическую обработку осуществляли в среде RStudio (Version: 2024.04.2+764), она включала проверку данных на нормальность (Q—Q-графики, избыточный эксцесс, асимметрия распределений, тесты Шапиро—Уилка и Левена), описательную статистику и сравнение количественных данных (нормированные концентрации железа), для чего применяли двухвыборочный t-тест (t-критерий Стьюдента) и критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Уровень p<0,05 принимали статистически значимым.

Результаты определения железа в ткани головного мозга с учетом дополнительных признаков и причин смерти, с учетом возраста умерших, представлены в таблице.

Результаты определения железа в образцах мозга мужчин и женщин разных возрастных групп

Примечание. ОЧМТ — открытая черепно-мозговая травма. * — погибшие с морфологическими признаками органического поражения или нейродегенерации.

Анализ приведенных в таблице результатов свидетельствует о том, что наиболее интенсивное депонирование железа наблюдалось в черном веществе (ср. знач._{черн.в-во}=88,9 мкг/г (26,4—173,2 мкг/г, SD=46 мкг/г)), наименее интенсивное — в гиппокампе (ср. знач._{гиппокамп}=34,9 мкг/г (14,9—67,7 мкг/г, SD=13,3 мкг/г)), в базальных ганглиях практически во всех случаях были получены сопоставимые значения (ср. знач._{прав.баз.гангл.}=76 мкг/г (30,7—119,4 мкг/г, SD=20,5 мкг/г)) и ср. знач._{лев.баз.гангл.}= 75,2 мкг/г (29—138,7 мкг/г, SD=25,5 мкг/г)). При оценке абсолютных и взвешенных по уровню железа в гиппокампе концентраций в черном веществе и базальных ганглиях установлено, что пиковые уровни концентраций определялись в возрастной группе 20—44 лет для черного вещества, 20—50 лет — для базальных ганглиев. Для черного вещества и базальных ганглиев были характерны более высокие концентрации в возрастной группе 50 лет и старше, чем в возрасте до 20 лет, при этом наиболее выраженные отличия наблюдались в черном веществе: для молодых ср. знач._{черн.в-во}=59,4 мкг/г, для пожилых ср. знач._{черн.в-во}=83,7 мкг/г. В гиппокампе, напротив, в старших возрастных группах было зарегистрировано минимальное снижение уровня депонирования железа (ср. знач._{гиппокамп}=34 мкг/г) по сравнению с умершими в возрасте до 20 лет (ср. знач._{гиппокамп}=38,7 мкг/г).

Двухвыборочный t-тест показал, что взвешенный уровень депонирования железа в черном веществе отличается в зависимости от наличия морфологических признаков хронической алкогольной интоксикации (5 случаев, ср. знач._хаи=4,63, ср. знач._{контроль}=2,16), эффект негативный, статистически значимый и большой (средняя разница = −2,48, 95% ДИ от −3,99 до −0,97, t(18)= −3,45, p=0,003). При сравнении абсолютных и взвешенных показателей в группах в зависимости от наличия признаков острой (7 случаев) и хронической наркотической интоксикации (4 случая), черепно-мозговой травмы (4 случая) и признаков органического поражения головного мозга и нейродегенерации (6 случаев — эпилепсия, детский церебральный паралич, возрастная дегенерация (2 случая), кисты и рубцы, спинальная травма с восходящей нейродегенерацией), отличий не выявлено. Таким образом, взвешенные по уровню железа в гиппокампе показатели депонирования железа в черном веществе в настоящем исследовании показали наибольший потенциал для дальнейшего использования в дифференциальной диагностике хронической алкогольной интоксикации. Этот показатель был устойчив к наличию сопутствующего наркотического опьянения, признаков хронической наркотической интоксикации, черепно-мозговой травмы, органического поражения головного мозга и нейродегенерации.

В результате ранее проведенных исследований посмертных образцов головного мозга с применением атомной абсорбционной спектрометрии было показано отличие в распределении железа в разных функционально-анатомических областях «здорового» головного мозга, с наиболее интенсивным депонированием железа в скорлупе; у пациентов с болезнью Альцгеймера уровень железа повышен в гиппокампе, а при болезни Паркинсона — в базальных ганглиях [12, 13].

В настоящем исследовании были получены данные о наиболее интенсивном накоплении железа в черном веществе среднего мозга. Отличия в результатах могут быть связаны с разными подходами к изъятию образцов биологического материала (черное вещество изолированно в ранее проведенных работах не исследовалось).

Результаты исследования D.J. Madden и J.L. Merenstein (2023) показали, что у пожилых лиц более высокие концентрации железа, по сравнению с молодыми, определяются в полосатом теле, хвостатом ядре, скорлупе, бледном шаре, красном ядре и черном веществе [14]. Наблюдения настоящего исследования подтверждают эти данные, а устойчивость уровня депонирования железа в гиппокампе к возрастным изменениям позволяет использовать его для получения взвешенного показателя (отношения концентрации железа в целевом участке мозга к концентрации железа в гиппокампе), что уменьшает число ложноположительных результатов, связанных с дефектами изъятия образцов, пробоподготовки и индивидуальных особенностей погибшего (умершего) при выявлении групповых отличий. По последним данным, иммуногистохимическими методами показана значительная вариабельность в микроанатомическом и субклеточном распределении железа в отдельных участках черного вещества головного мозга человека [15]. Этот факт также требует дальнейшего изучения для установления наиболее алкоголь-уязвимых участков черного вещества головного мозга.

Приведенные данные и результаты настоящего пилотного исследования свидетельствуют о том, что для посмертной диагностики хронической алкогольной интоксикации в комплексе иных методов исследования могут быть использованы относительно несложные в применении методы детекции патологического депонирования железа в ткани головного мозга, эффективность которых подтверждена прижизненными нейровизуальными исследованиями.

Расширение спектра доступных методик и алгоритмов дифференциальной диагностики указанного патологического состояния повышает качество экспертной работы и позволяет эксперту лучше обосновать суждения о причинах смерти. Одной из таких методик для применения в общем комплексе диагностики хронической алкогольной интоксикации является определение патологического депонирования железа в ткани головного мозга.

В ходе настоящего экспериментального исследования предложено сравнение абсолютных показателей концентрации железа наряду со взвешенными, получены данные о более высокой чувствительности к хронической алкогольной интоксикации взвешенных по уровню депонирования железа в гиппокампе концентраций железа в черном веществе среднего мозга и устойчивость определяемых концентраций к наличию черепно-мозговых травм разной давности, иной органической патологии и нейродегенеративным заболеваниям (за исключением болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера, не представленных в нашем материале).

Кроме того, в результате настоящего исследования не установлено влияния острой или хронической наркотической интоксикации на уровень депонирования железа в исследованных участках головного мозга. Полученные в пилотном исследовании результаты дают основание полагать, что целесообразно дальнейшее изучение динамики депонирования железа в головном мозге с определением диагностически значимых концентраций, а также дальнейшее совершенствование методик комплексной посмертной диагностики хронической алкогольной интоксикации, основанных на клинико-морфологических параллелях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.