Боковой амиотрофический склероз (БАС) — фатальное нейродегенеративное заболевание, связанное с поражением верхнего и нижнего мотонейронов. БАС относят к категории мультифакториальных заболеваний, в развитии которых важную роль отводят как средовым, так и генетическим факторам.

Частота семейных случаев заболевания составляет от 2 до 10% в различных популяциях [1, 12]. Описано не менее 15 генетических локусов, мутации в которых приводят к развитию редких семейных форм БАС и некоторых БАС-подобных синдромов. Большинство случаев заболевания — спорадические и не связаны с наследованием какой-либо мутации в одном из описанных генетических локусов, однако при спорадической форме БАС могут иметь значение определенные модифицирующие гены, формирующие генетическую предрасположенность к развитию нейродегенерации [2]. При оценке вклада этих генов в патогенез БАС используют метод генетических ассоциаций — исследование взаимосвязи «кандидатных» генетических полиморфизмов с заболеванием и его отдельными клиническими характеристиками. В настоящее время продолжается поиск новых генов-кандидатов, связанных с развитием БАС и модулирующих течение патологического процесса, среди которых описаны гены ANG (ангиогенин), HFE (фактор гемохроматоза), PON1 и PON2 (семейство параоксоназ), SMN1 и SMN2 (гомологи фактора выживаемости мотонейрона), полиморфные варианты которых ассоциированы с БАС у ряда пациентов в европейских, американских и китайской популяциях [20]. Уточняется роль генов APOE (аполипопротеин E) [3] и NEFH (тяжелая цепь нейрофиламентов) [4] в развитии данного заболевания.

Одним из изучаемых генов-кандидатов при БАС является ген сосудистого эндотелиального фактора роста — VEGF (vascular endothelial growth factor). Впервые он привлек внимание исследователей в 2001 г., когда была выведена линия мышей с симптомами болезни двигательного нейрона, гомозиготных по делеции гипоксия-чувствительного элемента (HRE) в промоторной области гена VEGF [18]. Ген VEGF расположен на 6-й хромосоме и имеет 8 экзонов [22]. Вследствие альтернативного сплайсинга синтезируются молекулы белка, состоящие из 121, 145, 165, 183, 189 и 206 аминокислот [22]. Синтез белка VEGF чрезвычайно важен на любом этапе онтогенеза. Он необходим для развития эндотелиальных, костных и хрящевых клеток, процессов ангиогенеза и гемопоэза [15, 16, 25]. Кроме того, описаны нейротрофические свойства VEGF и его влияние на проницаемость гематоэнцефалического барьера [11, 19]. Доказано, что свое влияние на нервные клетки VEGF осуществляет не только опосредованно — через изменение кровотока, но и непосредственно — путем увеличения экспрессии своих рецепторов на теле и аксоне двигательных нейронов [23].

Несмотря на развитие симптомов болезни двигательного нейрона у трансгенных животных в случае делеции HRE-промоторного сайта VEGF, спонтанные мутации в этой области гена при БАС не описаны [5, 10, 13], также не было выявлено ассоциации между полиморфизмами в промоторной области гена и развитием БАС [6]. До настоящего времени отсутствуют подтвержденные данные о роли эпигенетических модификаций гена VEGF в развитии БАС [17]. Тем не менее ассоциативная связь между геном VEGF и БАС установлена в ряде популяций мира. Так, D. Lambrechts и соавт. [13] и P. Terry и соавт. [21] выявили три значимых полиморфизма в гене VEGF (–2578C/A, –1154G/A и –634G/C), в отношении которых был установлен повышенный риск развития БАС у гомозиготных носителей «неблагоприятных» аллелей, проживающих в регионе Новая Англия на северо-востоке США. По данным крупного метаанализа [14], оценивавшего 11 исследований случай—контроль и включившего более 7000 пациентов из 8 европейских и 3 североамериканских популяций, носительство генотипа –2578A/A достоверно повышает риск развития БАС у мужчин. В некоторых европейских (Англия, Дания, Италия, Германия) [5, 8, 9, 24] и китайской популяциях [26] аллельные частоты по указанному полиморфному сайту в группе больных с БАС не отличались от контроля, однако были отмечены некоторые клинические особенности заболевания среди носителей генотипов риска. Так, в немецкой популяции было показано небольшое повышение риска развития БАС среди женщин—носительниц генотипа –2578A/A [9], а в исследовании на китайской популяции была выявлена ассоциация данного генотипа с дебютом БАС в молодом возрасте [7].

Таким образом, приведенные данные указывают на вовлечение гена VEGF в патогенез БАС, но при этом значение тех или иных полиморфизмов и конкретная роль данного гена и его белкового продукта в поражении мотонейронов требуют уточнения. В настоящее время ген VEGF рассматривается в качестве одного из молекулярных факторов, определяющих развитие БАС, а также привлекает внимание исследователей в качестве возможного объекта для воздействия и модификаций при разработке патогенетической терапии заболевания.

В данной работе нами представлены первые результаты анализа полиморфизма генотипа –2578С/A (rs699947) в гене VEGF в группе российских пациентов с БАС.

Обследовали 192 больных с БАС, 103 мужчин и 89 женщин, в возрасте от 20 до 83 лет (средний — 52,0±13,4 года), с длительностью заболевания от 0,3 до 21 года (в среднем — 2,6±3,2 года). Большинство (40%) пациентов страдали шейно-грудной формой заболевания, у 35,5% была диагностирована пояснично-крестцовая форма, у 22% — бульбарная, у 2% — первично-генерализованная, а у 1 (0,5%) — высокая. 6 (3%) пациентов из пяти неродственных семей имели положительный наследственный анамнез заболевания, остальные случаи были спорадическими. Все больные имели славянские этнические корни по одной или обеим родительским линиям и происходили из семей, проживающих на территории европейской части России. Контрольная группа включала 128 клинически здоровых лиц и была сопоставима с основной по полу, возрасту и этническому составу.

Выделение геномной ДНК производилось из цельной крови с помощью набора для выделения Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Cat. #A1125). Типирование однонуклеотидного полиморфизма –2578С/А (rs699947) в гене VEGF проводилось методом аллельной дискриминации с помощью 5'-нуклеазного (TaqMan) анализа. При этом для детекции аллельных вариантов в полиморфном сайте rs699947 использовались два аллель-специфичных TaqMan зонда FAM и R6G с различными флюоресцентными метками, позволяющими надежно различать гомо- и гетерозиготы при амплификации в режиме реального времени. Амплификация проводилась на приборе для осуществления полимеразной цепной реакции в реальном времени АНК-32 компании «Синтол».

Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ STATISTICA с использованием точного критерия Фишера, критерия Манна—Уитни, критерия &khgr;², отношения шансов (ОШ). Частоты носительства аллельных вариантов и генотипов по сайту rs699947 гена VEGF оценивали при помощи метода &khgr;² для сравнения наблюдаемой и ожидаемой частот.

Результаты генетического тестирования обследованных пациентов и группы контроля по полиморфному сайту rs699947 гена VEGF схематично представлены на рисунке.

Частота носительства генотипов (А) и отдельных аллелей (Б) VEGF в исследуемых группах.

Примечание. Светлые столбцы — контрольная группа, черные— группа пациентов с БАС. * — р<0,05 — достоверные различия с контролем.

Частота носительства генотипов (А) и отдельных аллелей (Б) VEGF в исследуемых группах.

]]>

Распределение частот носительства определенных аллелей также статистически значимо (&khgr;²=4,4; р=0,036) различалось в обеих группах. «Рисковый» аллель А чаще встречался в группе пациентов с БАС, однако для такого парного сравнения уровень различий не достигал статистической значимости (см. рисунок, Б).

Было рассчитано ОШ развития БАС среди лиц — носителей определенного генотипа VEGF. Шанс развития БАС был достоверно выше среди носителей генотипа –2578А/А (ОШ=1,66; доверительный интервал, ДИ, 1,03; 2,29). В подгруппе мужчин шанс развития заболевания у носителей данного генотипа увеличивался до 2,18 и также оставался статистически значимым (ОШ=2,18; ДИ 1,90; 2,47). При этом в подгруппе женщин было получено лишь небольшое повышение риска развития БАС среди носительниц генотипа –2578А/А, которое оказалось статистически незначимым.

С целью определения ассоциаций носительства «рискового» генотипа VEGF с клиническими особенностями заболевания (форма БАС, возраст дебюта и темп прогрессирования) и подтверждения гипотезы о роли VEGF как о факторе, утяжеляющем течение БАС, была проведена оценка ОШ для полиморфизма –2578А/С в различных возрастных подгруппах больных БАС, а также подгруппах пациентов со спинальной/бульбарной формами заболевания и быстрым/медленным темпом прогрессирования. Получено повышение шанса носительства «рискового» генотипа среди больных с дебютом БАС в возрасте до 45 лет (ОШ=1,3; ДИ 1,21; 1,40). Ассоциации носительства «рискового» генотипа с формой заболевания получено не было. В то же время шанс носительства генотипа –2578А/А был статистически значимо выше в группе с быстрым течением заболевания (ОШ=1,7; ДИ 1,27; 2,13). Данные особенности распределения генотипов VEGF в различных группах пациентов с БАС подтверждают точку зрения о модулирующем влиянии VEGF на течение заболевания, поскольку позволяют считать, что носительство «рискового» генотипа VEGF способствует дебюту БАС в более молодом возрасте и неблагоприятному быстрому темпу его прогрессирования.

Таким образом, в результате проведенного исследования выявлена ассоциация гена VEGF (генотип –2578A/A) с БАС у российских больных, особенно значимая для пациентов-мужчин. Установлена взаимосвязь носительства «рискового» генотипа с молодым возрастом дебюта заболевания и неблагоприятным быстрым темпом его прогрессирования. Полученные данные расширяют представления о роли семейства гипоксия-индуцибельных пептидных факторов в патогенезе селективной дегенерации двигательных нейронов у пациентов с БАС, что обосновывает проведение дальнейших исследований в эксперименте и клинике.