Рассеянный склероз (РС) является хроническим аутоиммунным заболеванием, характеризующимся демиелинизацией нервных волокон и воспалительными процессами в ЦНС. Одним из ключевых аспектов патогенеза РС является нарушение цитокинового баланса, что приводит к повышенной продукции провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (ИЛ)-6, и снижению уровня противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-10. Эти молекулы играют важную роль в регуляции иммунного ответа и могут оказывать значительное влияние на прогрессирование заболевания [1].

Уролитин A, метаболит, образующийся в результате микробиомной ферментации полифенола эллаготанина, привлекает внимание благодаря своим противовоспалительным свойствам и относительно высокой биодоступности. Исследования показывают, что уролитин A может модулировать иммунный ответ, подавляя в различных моделях уровень ИЛ-6 и разносторонне влияя ИЛ-10 [2, 3]. Показан благоприятный профиль безопасности уролитина A, его позитивное влияние на митохондриальную функцию, а также облегчение симптомов в модели РС in vivo [4, 5]. Это открывает новые горизонты для использования уролитина A в качестве средства для дополнительной терапии у пациентов с РС. Актуальны исследования иммунотропных эффектов уролитина A у пациентов с РС.

Цель исследования — изучить влияние уролитина A на цитокиновую продукцию у пациентов с РС и здоровых доноров.

Материал и методы

С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) проводилась оценка влияния уролитина A на стимулированную цитокиновую продукцию (ИЛ-6, ИЛ-10) мононуклеарными клетками периферической крови (МНПК) и макрофагами (МФ) у пациентов с РС и здоровых доноров. С этой целью брались образцы крови как у здоровых доноров, так и у пациентов с РС. Все пациенты с РС имели подтвержденный диагноз ремиттирующей формы РС (РРС), согласно критериям Мак-Дональда 2017 г., и получали терапию интерферонами не менее 6 мес. Все образцы забиралась у участников в момент отсутствия признаков острого респираторного заболевания, а также в момент ремиссии хронических заболеваний.

После забора венозной крови МНПК выделялись на градиенте плотности фиколл-урографин, клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 (НПП «Панэко», Россия), содержащей 2 мМ L-глутамина (НПП «Панэко», Россия) и 10% сыворотки FBS (Biosera, ЮАР). МНПК в концентрации 5·10⁴ на 200 мкл на лунку культивировали в 96-луночных планшетах с U-образным дном в присутствии (5 мкМ) и в отсутствии уролитина A. Для стимуляции цитокиновой продукции вносился липополисахарид (ЛПС, 0,1 мкг/мл). Культивация происходила в течение 24 ч. Супернатанты отбирались и замораживались при –80 °C до проведения анализа. Макрофаги культивировались из моноцитов (6 сут.), выделенных из МНПК при помощи метода залипания на поверхности, в дальнейшем все этапы проведения эксперимента были схожи с экспериментами для МНПК.

Для анализа уровня цитокинов проводился иммуноферментный анализ (использовались наборы «ИФА-Бест», Россия и Invitrogen).

Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения GraphPrism, версия 8.0. Для оценки нормальности распределения применялся критерий Шапиро—Уилка. Для определения значимости различий использовался критерий Стьюдента (для анализа относительной цитокиновой продукции) и критерий Манна—Уитни (для анализа абсолютной цитокиновой продукции).

Результаты

Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-6 и ИЛ-10 МНПК пациентов с РС и здоровых доноров

Нами исследован уровень спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции исследуемых цитокинов МНПК пациентов с РС и здоровых доноров (рис. 1). Выявлено, что спонтанная продукция ИЛ-10 значительно выше у здоровых доноров (203 (73; 453) пг/мл), чем у пациентов с РС (52 (0; 101) пг/мл) (p<0,01) (здесь и далее данные представлены в виде медианы, 25 и 75 перцентилей). Стимуляция ЛПС сглаживает различия в уровне продукции ИЛ-10, хотя тенденция к более высокой продукции ИЛ-10 у здоровых доноров сохраняется.

Рис. 1. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-10 и ИЛ-6 у пациентов с РС (n=15) и здоровых доноров (n=9).

Здесь и на рис. 2 и 3 представлены абсолютные значения в пг/мл. Столбцы — медиана и межквартильный размах.

Различия в продукции ИЛ-6 МНПК между здоровыми донорами и пациентами с РС представляют собой обратную картину по сравнению с ИЛ-10. Так, у здоровых доноров имеется тенденция к меньшей нестимулированной продукции ИЛ-6 по сравнению с пациентами с РС. Также нами показано значимо меньшая ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-6 у здоровых доноров (5800 (2800;8100) пг/мл) по сравнению с пациентами с РС (8700 (5500;11600) пг/мл).

Влияние уролитина A на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-10 МНПК пациентов с РС и здоровых доноров

Мы оценили влияние уролитина A на уровень ИЛ-10 у пациентов с РС (n=16) и здоровых доноров (n=9) (рис. 2). После стимуляции образцов с уролитином A (5 мкМ) отмечена тенденция к повышению уровня данного цитокина до 112 (93; 130) пг/мл у пациентов с РС, и до 106 (101; 110) пг/мл у здоровых доноров (данные приведены в виде относительных значений, в процентах относительно ЛПС-стимулированного контроля).

Рис. 2. Уровень ИЛ-6 и ИЛ 10 МНПК у пациентов с РС и здоровых доноров после добавления уролитина A (5 мкМ).

Здесь и на рис. 3: UA 5 — уролитин A (5 мкМ), ns — нестимулированная продукция, LPS — липополисахарид.

Влияние уролитина A на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-10 макрофагами пациентов с РС и здоровых доноров

Также мы исследовали влияние уролитина A на функциональную активность МФ от пациентов с РС и здоровых доноров. К показателям, отражающим функциональную активность МФ, можно также отнести продукцию цитокинов, в частности, ИЛ-6 и ИЛ-10.

После добавления уролитина A отмечено подавление стимулированной активности МФ (рис. 3) — снижение уровня ИЛ-6 до 92 (88; 98) пг/мл у пациентов с РС и до 93 (79; 101) пг/мл у здоровых доноров (данные приведены в виде относительных значений, в процентах относительно ЛПС-стимулированного контроля).

Рис. 3. Уровень ИЛ-6 МФ у пациентов с РС и здоровых доноров после добавления уролитина A (5 мкМ).

В отношении продукции ИЛ-10 МФ не отмечено существенных отличий после добавления уролитина A по сравнению с ЛПС-стимулированным контролем.

Обсуждение

Нами показано, что базальный и стимулированный уровень продукции ИЛ-10 МНПК выше у здоровых доноров по сравнению с пациентами с РС. Уролитин A повышает стимулированную продукцию ИЛ-10 МНПК пациентов с РС. Уровень ИЛ-6 изменяется в противоположную сторону по сравнению с уровнем ИЛ-10: у здоровых доноров базальный и стимулированный уровень ИЛ-6 ниже, чем у пациентов с РС. Уролитин A снижает ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-6 макрофагами пациентов с РС и здоровых доноров.

При РС ИЛ-10 способствует снижению воспаления и препятствует прогрессированию заболевания. Напротив, многие работы свидетельствуют о связи повышения ИЛ-6 при РС с неблагоприятным прогнозом [1, 6]. В литературе имеются данные, что МНПК пациентов с РС in vitro выделяют меньше ИЛ-10 и больше ИЛ-6 по сравнению с МНПК здоровых доноров. Точные механизмы этого дисбаланса пока неясны, но результаты исследований указывают на изменения в сигнальных путях ИЛ-6 и ИЛ-10, усугубляющие нарушение их баланса при РС [1].

Известно, что ИЛ-6 связывается с рецептором ИЛ-6R, активируя сигнальный путь через гомодимеризацию гликопротеина gp130, что приводит к фосфорилированию STAT3, его ядерной транслокации и регуляции генов. Также ИЛ-6 активирует MAPK-каскад и индуцирует экспрессию множества генов. Существует сложный механизм обратной связи, регулирующий продукцию ИЛ-6 посредством SOCS1 (супрессор цитокиновой передачи 1), SOCS3 и PIAS (протеиновый ингибитор активированных STAT). Важную роль играет и растворимая форма рецептора к ИЛ-6 (sIL-6R), которая обеспечивает «транс-сигнализацию» путем связывания с ИЛ-6 и только затем — с мембранным gp130, что, в частности, вносит значительный вклад в патогенез волчаночного нефрита. ИЛ-6 снижает уровень железа (посредством гепцидина, снижающего его всасывание), опосредует синтез белков острой фазы, усиливает иммунный ответ, в том числе дифференцировку клеток Th-17 [1, 7].

ИЛ-10 связывается со специфическим рецептором IL-10R, состоящим из двух α- и двух β-субъединиц. Рецептор IL-10Rα экспрессируется на большинстве гемопоэтических клеток, особенно высок его уровень на антигенпрезентирующих клетках и микроглии, тогда как в наивных CD4+ T-клетках его экспрессия возрастает только после активации. После связывания ИЛ-10 активируются тирозинкиназы Jak1 и Tyk2, фосфорилирующие IL-10Rα, что приводит к рекрутированию и фосфорилированию STAT3, который затем перемещается в ядро, активируя транскрипцию генов, таких как SOCS3, подавляющих по механизму отрицательной обратной связи экспрессию провоспалительных цитокинов (включая ИЛ-6 и ФНО) [8]. Также активируется транскрипция Bcl3 и Ddit4, ингибирующих NF-κB и mTOR, что способствует подавлению воспалительного ответа и разрешению воспаления [8, 9]. ИЛ-10 стимулирует митофагию, устраняя дисфункциональные митохондрии, характеризующиеся низким мембранным потенциалом и высоким уровнем активных форм кислорода [9].

У пациентов с РС показана сниженная экспрессия гена ИЛ-10 по сравнению со здоровыми донорами [10]. Важная противовоспалительная роль ИЛ-10 в патогенезе и терапии РС может подчеркиваться тем фактом, что введение глюкокортикоидов пациентам с РС с обострениями увеличивает экспрессию и продукцию ИЛ-10 МНПК [11]. В целом повышение уровня ИЛ-10 связано с положительным ответом на терапию ПИТРС [8].

Способность уролитина A повышать продукцию ИЛ-10 МНПК пациентов с РС свидетельствует о перспективности этого полифенола как потенциального средства для терапии РС. Также имеются данные, что уролитин A облегчает симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита — животной модели РС [5]. Снижение продукции ИЛ-6 макрофагами под влиянием уролитина A, показанное в настоящей работе, также может иметь важное значение как потенциальный терапевтический эффект, заключающийся в модуляции поляризации макрофагов для перевода их более противовоспалительное и репаративное состояние при РС [12]. Как известно, в патогенезе РС важную роль играют клетки микроглии, являющиеся резидентными макрофагами ЦНС. С результатами нашей работы согласуются данные исследований на клетках микроглии BV2, которые выявили, что уролитин A подавляет провоспалительные цитокины (ФНО-α и ИЛ-6) посредством ингибирования фосфорилирования и ацетилирования p65 NFκB, что вносит вклад в его нейропротекторный эффект [13].

Заключение

Нами показан меньший уровень продукции ИЛ-10 МНПК пациентов с РС по сравнению с МНПК здоровых доноров. ИЛ-6, напротив, продуцируется в большей степени МНПК пациентов с РС. Наши данные свидетельствуют о способности уролитина A повышать уровень продукции ИЛ-10 МНПК пациентов с РС и здоровых доноров. Среди ограничений данной работы стоит отметить малый объем выборки. В целом, результаты настоящей работы в комплексе с данными других исследований свидетельствуют о перспективности изучения уролитина A в качестве средства дополнительной терапии при РС. Принимая во внимание благоприятный профиль безопасности уролитина A, а также его сравнительно высокую биодоступность среди других полифенолов, можно рекомендовать уролитин A для клинических исследований в качестве средства дополнительной терапии РС. Также необходимы дальнейшие исследования иммунотропных эффектов уролитина A.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.