Ремиттирующий рассеянный склероз: клинико-иммунологические аспекты патологии на примере молекул Sema4D и CD72

Ремиттирующий тип течения является наиболее распространенным при рассеянном склерозе (РС), приводящим к ранней инвалидизации лиц трудоспособного возраста [1—3], ввиду чего необходима разработка новых способов диагностики и терапии [4]. Тесное взаимодействие нервной и иммунной систем при РС в стадию как ремиссии, так и обострения предполагает выявление новых молекулярных мишеней [4]. С учетом инициации заболевания на периферии по-прежнему актуально исследование маркеров воспаления в крови пациентов.

На основании экспериментальных данных в качестве иммунопатологического звена ремиттирующего РС (РРС) предполагаются белковые молекулы обширного семейства семафоринов и их рецепторы [4—6], участие которых изначально было выявлено в качестве направляющих роста аксонов в период нейронального развития [7, 8]. Исследования, проведенные на животных моделях, касаются патогенеза различных аутоиммунных, ревматологических и онкологических заболеваний с вовлечением семафоринов [4], в частности Sema4D, отнесенного по классу дифференцировки лимфоидных клеток к молекуле CD100 [9]. Показано, что Sema-4D-дефицитные мыши устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, модели РС у животных [4, 10]. Повышение экспрессии Sema4D выявлено на поверхности T-лимфоцитов и в сыворотке крови человека при HTLV1-ассоциированной миелопатии [11]. По данным экспериментов in vitro, Sema4D индуцирует апоптоз незрелых олигодендроцитов, принимающих активное участие в миелинизации нервных волокон [11].

Sema4D не теряет свою биологическую активность как на клетках иммунной системы, особенно на T-лимфоцитах, так и в растворимой форме, в которую он способен трансформироваться из мембранной формы за счет протеолитического отщепления от поверхности клеток [12]. Sema4D распространяет свои эффекты как в иммунной системе, используя рецептор CD72 [13], так и в ЦНС, используя Plexin-B1 [14].

Молекула-рецептора CD72 способствует иммунным реакциям семафорина, будучи широко представленной на B-лимфоцитах, является негативным регулятором B-клеточной активации. В свою очередь связь Sema4D с CD72 подавляет эту негативную регуляцию, что теоретически должно вести к гиперактивации клеток [15]. Следует учитывать тот факт, что B-лимфоциты наряду с T-клетками имеют отношение к перманентному патологическому аутоиммунному процессу. Истощение их популяции рассматривается как важная стратегия терапии РРС, в частности при применении моноклональных антител ритуксимаб и окрелизумаб, цитостатического препарата митоксантрон [1, 16].

Цель исследования — изучение экспрессии Sema4D (CD100), рецептора CD72 и роли Sema4D-CD72-зависимого сигнала в контроле функций иммунокомпетентных клеток при РРС.

Исследование было открытым, одномоментным, контролируемым. Обследованы 76 больных, из которых 52 с РРС (41 — в стадии ремиссии и 11 — в стадии обострения) не получали препаратов, изменяющих течение РРС, и 24 здоровых донора (ЗД). Среди пациентов с РРС 35 (67,3%) женщин и 17 (32,7%) мужчин в возрасте 18—55 лет. Диагноз РС основывался на критериях McDonald [17], РРС уточнен по принятым критериям [18]. Оценка уровня инвалидизации проводилась по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale) [19]. Превалирующими вариантами дебюта РРС являлись сенсорные нарушения (25%) и ретробульбарный неврит (17%). Клиническая характеристика пациентов с РРС представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов с РС; Me (LQ;UQ)

В иммунологическом исследовании использовали гепаринизированную венозную кровь, из которой выделяли плазму и мононуклеарные клетки периферической крови. Алгоритм лабораторных исследований представлен на рис. 1. Важным критерием исключения явилось наличие в анамнезе системного воздействия глюкокортикостероидов в течение как минимум 30 дней до забора образцов периферической крови, учитывая их возможное иммунодепрессивное воздействие на клеточное звено иммунной системы [20].

Рис. 1. Алгоритм лабораторных исследований.

** — исследования, проведенные у пациентов с РС в стадии обострения.

Полученные мононуклеарные клетки периферической крови были использованы для оценки экспрессии (присутствия молекулы на мембране) Sema4D ex vivo — T-лимфоцитами, для чего применяли субпопуляционные маркеры CD3, а также CD4/CD8, которые определяют основные функциональные субпопуляции лимфоцитов. Выделяли не T-клеточную субпопуляцию CD3^– лимфоцитов, состоящую из B-клеток, естественных киллеров и моноцитов. Моноклональные антитела к каждой из мембранных молекул (CD3, CD4 или CD8, CD100) были мечены разными флуорохромными метками. При помощи проточной цитометрии оценивали процент CD100-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения (Mean Fluorescence Intensity, MFI, условные единицы — у.е.), отражающую количество (плотность) молекул на мембране клетки.

Для оценки изменений в экспрессии Sema4D T-лимфоцитами в условиях, имитирующих иммунный ответ, определяли ее в культуре — в спонтанном варианте (в полной питательной среде) и в условиях активации. Клетки культивировали в течение 1 и 18 ч с использованием активатора форболмиристата ацетата (ФМА), после чего определяли экспрессию Sema4D на мембране в общей популяции T-лимфоцитов (CD3⁺ клеток). Оценивали процент CD100-позитивных клеток в клеточной субпопуляции и среднюю интенсивность их свечения.

Уровень растворимого Sema4D (sSema4D) оценивали в плазме крови и супернатантах клеточных культур (спонтанный вариант и вариант с активатором), полученных по окончании 18-часового культивирования T-лимфоцитов, иммуноферментным методом. У пациентов в стадии обострения РС были оценены 2 иммунологических показателя — экспрессия Sema4D/CD100 на T-лимфоцитах периферической крови ex vivo и уровень sSema4D в плазме крови.

Экспрессию рецептора для Sema4D — CD72 — B-лимфоцитами определяли ex vivo в суспензии мононуклеарных клеток периферической крови с использованием клеточного маркера CD19⁺. Оценивали процент CD72-позитивных клеток в популяции CD19⁺ клеток и среднюю интенсивность их свечения.

Для оценки влияния молекулы Sema4D на B-лимфоциты их культивировали в течение 48 ч в присутствии T-клеток в спонтанном варианте, на фоне активации (с использованием ФМА и иономицина), а также на фоне блокады Sema4D-CD72-сигнала (отдельно проводили блокаду Sema4D и отдельно блокаду его рецептора CD72). Изучали экспрессию 2 провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли-альфа — TNF-α и лимфотоксин-альфа — LT-α) и одного противовоспалительного (интерлейкин-10 — IL-10) в CD19⁺ клетках. Оценивали процент клеток, несущих цитокин.

Статистическая обработка данных исследования проводилась непараметрическими методами с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 («Stat Soft Inc.», США). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

При оценке экспрессии Sema4D/CD100 T-лимфоцитами ex vivo у пациентов с РС и ЗД было выявлено, что T-лимфоциты конститутивно экспрессируют маркер CD100 у всех обследуемых [21, 22]. Однако уровень экспрессии Sema4D на T-лимфоцитах (MFI) — значимо превалировал в субпопуляциях клеток у пациентов с РС (n=37) в сравнении с ЗД (n=20): CD3⁺4⁺ (p=0,000), CD3⁺8⁺ (p=0,000), CD3— (p=0,003) (рис. 2).

Рис. 2. Уровень экспрессии Sema4D/CD100 (MFI , у.е.) в субпопуляциях мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с РС и ЗД.

а — CD3⁺4⁺; б) CD3⁺8⁺; в) CD3^–; Me (LQ; UQ).

Значимых отличий по уровню экспрессии Sema4D в субпопуляциях мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с РС в стадии ремиссии (n=27) и обострения (n=10) нами не было установлено, что предполагает отсутствие зависимости экспрессии Sema4D от стадии демиелинизирующего процесса. Не обнаружено отличий в уровне экспрессии Sema4D на мембране лимфоцитов в зависимости от пола обследованных. Установлена корреляционная связь между количеством CD100⁺ клеток в субпопуляции CD3⁺CD4⁺ лимфоцитов и значением FS2 (функции ствола мозга), шкалы EDSS (R=0,418, p=0,010), FS7 (когнитивные функции, R=0,351, p=0,033), FS8 (передвижение, R=0,338, p=0,041), а также между уровнем экспрессии Sema4D/CD100 на CD3^– клетках и значением FS2 (стволовые функции, R=0,406, p=0,014). При РС отмечен более значимый интервал снижения уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3⁺ клеток в условиях активации 18-часовых клеточных культур в сравнении с показателем 1-часовых клеточных культур (рис. 3, p=0,007) и для 18-часовых клеточных культур в сравнении с показателем ex vivo(см. рис. 3, p=0,000) [21, 22]. При этом у пациентов с РС показатели уровня экспрессии Sema4D/CD100 на мембране CD3⁺ клеток были статистически значимо выше в сравнении с таковыми в группе ЗД на большинстве этапов культивирования (табл. 2).

Рис. 3. Уровень экспрессии Sema4D/CD100 для интактных и активированных T-лимфоцитов пациентов с РС (n=10) в культуре в зависимости от длительности культивирования (Me).

p_1—2=0,169, p_1—3=0,009, p_2—3=0,022, p_1—4=0,013, p_1—5=0,005, p_4—5=0,005, p_2—4=0,017, p_3—5=0,005.

Таблица 2. Сравнительные данные по уровню экспрессии Sema4D/CD100 для CD3⁺ клеток при разной длительности культивирования в обследуемых группах; у.е., Me (LQ;UQ)

Уровень sSema4D в плазме крови был повышен как у пациентов с РС (n=21, p=0,012), так и у пациентов в стадии ремиссии (n=14, p=0,031) и обострения (n=7, p=0,018) в сравнении с ЗД (n=7) (рис. 4). Отличий по уровню sSema4D в плазме между пациентами, находящимися в стадии ремиссии (4,62; 2,92—5,88 у.е., n=14) и обострения (7,08; 3,37—9,63 у.е., n=7), выявлено не было (p=0,371). Не выявлено зависимости уровня sSema4D в плазме от клинических особенностей пациентов.

Рис. 4. Уровень sSema4D в плазме крови и супернатантах клеточных культур пациентов с РС в стадии ремиссии и ЗД (Me, нг/мл).

1 — p<0,05 при сравнении уровня sSema4D в супернатантах 18-часовой культуры интактных T-лимфоцитов с его уровнем в плазме, критерий Вилкоксона; 2 — p<0,05 при сравнении уровня sSema4D в активированном и спонтанном вариантах супернатанта 18-часовой клеточной культуры, критерий Вилкоксона; 3 — p<0,05 при сравнении уровня sSema4D в активированном варианте супернатанта 18-часовой клеточной культуры с его уровнем в плазме, критерий Вилкоксона; * — p<0,05 в сравнении со здоровыми донорами, критерий Манна—Уитни.

У пациентов с РС в стадии ремиссии (n=15) и ЗД (n=14) уровень sSema4D в супернатантах 18-часовых клеточных культур (активированного и спонтанного вариантов) значимо возрастал в сравнении с его уровнем в плазме, преобладая при РС в активированном варианте супернатанта 18-часовых клеточных культур в сравнении с ЗД (см. рис. 4).

Нарастание уровня sSema4D при культивировании клеток у пациентов с РРС представляется логичным в связи с выявленным ранее высоким уровнем экспрессии мембранного Sema4D: чем выше уровень мембранного семафорина, тем более должно быть выраженно повышение sSema4D в условиях клеточной активации. Точно также это согласуется с выявленным снижением у пациентов с РРС уровня экспрессии Sema4D на мембране в ходе 18-часового культивирования лимфоцитов (см. рис. 3), учитывая экспериментальные данные о слущивании Sema4D с мембраны с переходом в растворимую форму [12].

У пациентов в стадии ремиссии РРС (n=14) прослежена обратная корреляция между уровнем sSema4D в плазме и длительностью заболевания (R= –0,567, p=0,035), что согласуется с преобладанием воспалительных изменений (демиелинизации) в дебюте данной патологии. При экзацербации РРС (n=7) прослежена прямая корреляция между уровнем sSema4D в плазме и количеством контрастируемых очагов в головном мозге (R=0,900, p=0,037), что может отражать усиление воспаления и демиелинизации в ЦНС в данную стадию заболевания. Выявлено значимое снижение количества CD72-позитивных CD19⁺ клеток у пациентов с РС в сравнении с ЗД (табл. 3) [21, 22].

Таблица 3. Доля B-лимфоцитов, несущих рецептор CD72, и показатели уровня экспрессии CD72 в сравниваемых группах; у.е., Me (LQ;UQ)

Также у пациентов с РС было повышено процентное содержание B-лимфоцитов (% CD19⁺ клеток) в периферической крови по сравнению с ЗД (см. табл. 3) [21, 22]. Учитывая, что CD72 является негативным регулятором функции B-клеток [23], а связывание Sema4D с рецептором CD72 отменяет негативное действие CD72 на B-клеточную активацию [24], установленное в нашем исследовании повышение уровня экспрессии Sema4D интактными T-лимфоцитами в периферической крови пациентов с РС в сравнении с ЗД указывает на возможное участие семафорина в гиперактивации B-клеточного звена иммунной системы при РРС [21, 22].

Исследован профиль цитокинов, синтезируемых B-лимфоцитами при их культивировании (48 ч) в присутствии T-клеток. В спонтанном варианте (без активации клеток) B-клетки ЗД синтезируют значимо меньшее количество провоспалительных цитокинов, TNF-α и LT-α, в сравнении с больными РС (p=0,003 и p=0,001 соответственно) и большее количество противовоспалительного IL-10 (p=0,001) (табл. 4).

Таблица 4. Экспрессия цитокинов TNF-α, LT-α, IL-10 CD19⁺ клетками периферической крови (процент цитокин-позитивных клеток в популяции) в сравниваемых группах; %, Me (LQ;UQ)

Примечание.¹ — p<0,05 в сравнении со спонтанным вариантом; ² — p<0,05 в сравнении с ЗД.

Наблюдалось смещение профиля всех исследуемых цитокинов, синтезируемых B-лимфоцитами, в условиях активации клеток у пациентов с РС (см. табл. 4): увеличение процента B-клеток, содержащих TNF-α (p=0,003), LT-α (p=0,003) и IL-10 (p=0,040). При этом в активированном варианте процент клеток, несущих цитокин, преобладал у пациентов с РС только для TNF-α (p=0,015).

В свою очередь при блокаде Sema4D-CD72-сигнала тоже происходило изменение профиля цитокинов в сравнении со спонтанным вариантом без ингибитора у пациентов с РС: снижение процента B-клеток, продуцирующих TNF-α (p=0,004 при блокаде Sema4D и p=0,006 при блокаде CD72) и LT-α (p=0,017 при блокаде Sema4D и p=0,004 при блокаде CD72). Это предполагает участие Sema4D в активации B-клеточного звена при РС при взаимодействии с рецептором CD72, в индукции синтеза провоспалительных цитокинов. Что касается противовоспалительного цитокина IL-10, то увеличение доли B-клеток, продуцирующих данный цитокин, происходило изолированно на фоне блокады Sema4D (p=0,008).

Учитывая совокупность измененных иммунологических показателей, с акцентом на повышение экспрессии Sema4D в иммунной системе при РРС, можно предложить несколько механизмов вовлечения семафорина в патогенез данного заболевания. Во-первых, Sema4D способен вызывать апоптоз незрелых нейронов и олигодендроцитов [11], и у пациентов с РС он, вероятно, оказывает непосредственное поражающее действие на нервные ткани, причем как в растворимой форме с проникновением через поврежденный при РС гематоэнцефалический барьер, так и в мембранной форме за счет инфильтрации центральной нервной системы T-лимфоцитами и их активации в ответ на аутоантигены. Во-вторых, так как мембранный Sema4D может выступать не только в качестве лиганда, но и как рецептор, проводя сигнал в T-клетку, причем сигнал костимулирующий [10], повышение его экспрессии при РС влияет на усиление активации T-лимфоцитов, в том числе аутоспецифичных T-клеток — как во вторичных лимфоидных органах, так и в ЦНС. Исходя из полученных данных, мы представили роль Sema4D в иммунной системе в условиях относительной нормы и аутоиммунной патологии в виде следующей схемы (рис. 5).

Рис. 5. Гипотетическая схема воздействия Sema4D/CD100 на клетки иммунной системы здоровых доноров и пациентов с РС (пояснения в тексте).

Научно обосновано использование SemaD в качестве мишени при терапии РРС [4], что, несомненно, предполагает дальнейшие исследования с использованием моноклональных антител к данной молекуле. При положительном решении о применении анти-Sema4D-препаратов необходимо будет учитывать эффекты семафорина не только в центральной нервной системе, но и в иммунной системе пациентов с РРС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.