Ген MTHFR кодирует метилентетрагидрофолатредуктазу — один из ключевых ферментов фолатного цикла. Однонуклеотидные замены (SNP) rs1801133 (A222V, 677C>T) и rs1801131 (E429A, 1298A>C) в этом гене приводят к образованию термолабильной формы фермента, снижению его активности и, как следствие, к повышению уровня гомоцистеина в крови и снижению синтеза метионина. Накопление гомоцистеина обусловливает повреждение эндотелия сосудов и оказывает нейротоксический эффект, а дефицит метионина может приводить к нарушению синтеза и метилирования ДНК [1, 2]. Гипергомоцистеинемия является важным фактором риска развития таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз, венозный тромбоз, инсульт и сахарный диабет, а также ассоциирована с риском нейродегенеративных заболеваний и фетоплацентарной недостаточности [1—4]. Для аллеля Т полиморфизма rs1801133 показана ассоциация с возникновением дефектов нервной трубки у плода и другими патологиями беременности, развитием тромбофилии, ишемического инсульта (ИИ), шизофрении, осложнений сахарного диабета. rs1801131 рассматривается как возможный фактор риска развития тромбозов, ИИ и акушерской патологии [2—4].
В свою очередь большинство патологий, ассоциированных с геном MTHFR, являются многофакторными — генетическая предрасположенность к ним определяется совместным влиянием многих полиморфных локусов, как, например, в случае с И.И. Информация о частотах аллелей в популяции может быть использована в алгоритмах расчета генетических рисков с целью выявления лиц, относящихся к группе с высоким риском развития патологии для проведения своевременных профилактических мероприятий [3, 5, 6]. Известно, что частоты аллелей и генотипов rs1801133 и rs1801131 в разных популяциях отличаются [1], однако информации о частотах их генотипов и гаплотипов в отечественной популяции недостаточно.
Цель исследования — определение частот аллелей и генотипов rs1801133 и rs1801131 в выборках лиц без признаков острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) на момент обследования и выборках больных атеротромботическим (АТ) и кардиоэмболическим (КЭ) подтипами ИИ у жителей Московского региона, а также сопоставление полученных частот с частотами в других европейских популяциях.
Материал и методы
В работе использовано 645 образцов геномной ДНК человека, выделенной из клеток периферической крови с помощью набора реагентов РИБО-преп (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). Группу популяционного контроля составили жители Московского региона (n=360) трех возрастных групп (до 45 лет, 46—60 и 61—75 лет, 178 мужчин и 182 женщины) без признаков ОНМК на момент взятия клинического материала, и не являющихся родственниками [7]. Группу больных с ИИ составили 111 пациентов с АТ и 81 с КЭ подтипами ИИ, госпитализированных в Научный центр неврологии с диагнозом ИИ в 2013—2016 гг. [6]. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из крови пациентов, взятой для стандартных лабораторных анализов. Пациенты давали согласие на использование полученного материала в научных и исследовательских целях без использования персональных данных (в обезличенном виде). Также в работе использовали результаты генотипирования пациентов с АТ (59) и КЭ (34) подтипами ИИ, проведенного ранее в рамках клинических испытаний набора реагентов для определения риска развития ИИ1.
Средний возраст первого инсульта у больных составлял 63 года для АТ и 64 для КЭ, выборка содержит 114 женщин (65 АТ и 49 КЭ) и 171 мужчину (105 АТ и 66 КЭ).
Генотипирование проводили методом мультиплексной ПЦР в реальном времени с конформационно-блокированными (LNA) зондами, аналогично методике, использованной в [7]. При создании и апробации методики, а также для верификации результатов проводилось определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, содержащих SNP, с помощью пиросеквенирования [8].
Информация о частотах аллелей rs1801133 и rs1801131 в европейских популяциях (Caucasian) была получена из соответствующих баз даных международных проектов 1000 Genomes Project (выборка EUR, n=503) [9] и International HapMap Project (выборка HapMap-CEU, n=113) [10].
Статистический анализ распределения частот аллелей и генотипов в выборках и оценку их ассоциации с риском развития ИИ проводили в среде R с использованием стандартных функций для расчета критерия χ2 Пирсона и точного теста Фишера [11]. Оценку LD между локусами проводили с использованием коэффициента корреляции r2 Пирсона посредством среды R и пакета genetics (genetics: Population Genetics. R package ver. 1.3.8.1) [12]. Для анализа отклонения частот генотипов от равновесия Харди—Вайнберга использовали пакет HardyWeinberg (HardyWeinberg: Statistical Tests and Graphics for Hardy—Weinberg Equilibrium. R package ver. 1.6.0) [13, 14]. Статистически значимыми считались различия при значении p<0,05.
Результаты
В результате проведенного анализа частот аллелей и генотипов обоих SNP в возрастных группах здорового контроля не было выявлено статистически значимых различий (p>0,05). Также было установлено, что в контрольной группе между выборками разного пола статистически значимых различий по частотам аллелей, анализируемых SNP, нет (p>0,05), поэтому в дальнейшем мы не разделяли контроль по возрасту и полу.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов изучаемых локусов в выборках пуляционного контроля и у больных с АТ и КЭ подтипами ИИ представлен в табл 1. 
При проведении сравнительного анализа выявлено статистически значимое различие между выборкой населения Московского региона и выборкой 1000 Genomes Project (p<1·10–4) по частотам аллелей rs1801133. Отдельный анализ частот аллелей в субпопуляциях EUR 1000 Genomes Project [9] по состоянию на 01.08.18 показал, что статистически значимыми являются различия между выборкой населения Московского региона и выборками IBS (Испания) и TSI (Италия) (p<1·10–5), в то время как для остальных выборок различия незначимы (p>0,05) (табл 3). 
Отличия от выборки HapMap для обоих полиморфизмов и от выборки 1000 Genomes Project по частотам аллелей rs1801131 были статистически незначимы (p>0,05). Также было проведено сравнение полученных частот аллелей и генотипов обоих полиморфизмов с частотами для русского населения Томска [15] и коренного населения Санкт-Петербурга [16]. По распределению сочетаний генотипов rs1801133/rs1801131 выборка населения Московского региона соответствует северо- и центральноевропейским субпопуляциям и так же, как они, отличается от южноевропейских выборок IBS и TSI (см. рисунок). 
Обсуждение
Определены частоты аллелей и генотипов двух клинически значимых SNP в выборке населения Московского региона. Выявленные частоты близки к описанным ранее для русского населения других территорий [15, 16], что позволяет использовать полученные данные для расчета генетического риска заболеваний как популяционные значения для русского населения независимо от географической принадлежности исследуемой выборки.
Обнаруженные отличия в частотах аллелей анализируемых полиморфизмов от частот в других европеоидных популяциях свидетельствуют о генетических особенностях исследуемой популяции, которые необходимо учитывать при расчете среднепопуляционных и индивидуальных рисков развития заболеваний, ассоциированных с этими SNP, и оценке возможного совместного вклада комбинаций аллелей. Значимые отличия в частотах аллелей rs1801133 от популяций Южной Европы (выборки TSI и IBS 1000 Genomes Project), чем от северных популяций (выборки GBR, FIN и CEU 1000 Genomes Project) согласуется с описанным ранее географическим градиентом частот аллелей этого локуса в Европе и Северной Америке с наибольшей частотой аллеля Т в Испании и Италии [1, 15] (см. рисунок).
Выявленное в данной работе отсутствие в исследуемых выборках сочетаний генотипов CT/CC, TT/AC и TT/CC (rs1801133/rs1801131) (см. табл. 2) соответствует показанной в отечественных и зарубежных исследованиях крайне низкой частоте сочетания аллелей rs1801133 T/rs1801131 C (0—0,5% в большинстве изученных популяций) [16—18].
В результате проведенного анализа частот исследуемых SNP в выборке популяционного контроля и у больных с АТ и КЭ подтипами ИИ не выявилено ассоциаций между генотипами по обоим полиморфизмам и их сочетаниями с риском развития различных подтипов ИИ, что может быть связано как с недостаточным объемом проанализированных выборок, так и с отсутствием влияния этих SNP на риск возникновения И.И. Ранее для полиморфизма rs1801133 в ряде популяций была показана ассоциация аллеля Т с ИИ [1, 5]. Для более достоверной оценки влияния полиморфизмов rs1801133 и rs1801131, а также комбинаций их аллелей на риск развития ИИ требуются дополнительные исследования, учитывающие другие независимые факторы риска развития ИИ (пол, возраст, сопутствующие заболевания, наличие аллелей риска в других генах) [6].
Полученные данные о частотах аллелей и генотипов могут быть использованы для анализа генетических рисков других заболеваний и состояний, связанных с генетически обусловленным нарушением фолатного обмена [2].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Дрибноходова О.П. — https://orcid.org/0000-0003-4918-4907
Корчагин В.И. — e-mail: vitaly-korchagin@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0003-2264-6294
Миронов К.О. — https://orcid.org/0000-0001-8207-9215
Дунаева Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-4477-8506
Титков А.В. — e-mail: anton.titkov@bk.ru; https://orcid.org/0000-0001-7548-9267
Аксельрод Э.В. — https://orcid.org/0000-0001-6008-4339
Раскуражев А.А. — https://orcid.org/0000-0003-0522-767X
Танашян М.М. — https://orcid.org/0000-0002-5883-8119
Иллариошкин С.Н. — https://orcid.org/0000-0002-2704-6282
Платонов А.Е. — https://orcid.org/0000-0001-7450-0081
Шипулин Г.А. — https://orcid.org/0000-0002-3668-6601
Автор, ответственный за переписку: Корчагин Виталий Иванович — e-mail: vitaly_korchagin@rambler.ru
1Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Дунаева Е.А., Корчагин В.И., Платонов А.Е., Шипулин Г.А. Способ определения индивидуального генетического риска развития ишемического инсульта. Патент Р.Ф. на изобретение от 09.03.17 № 2612630 Бюл. № 7.