Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) занимают ведущие позиции в структуре заболеваемости и смертности населения и являются важной медико-социальной проблемой [1, 2]. Несмотря на значительные улучшения в области первичной профилактики и терапии в остром периоде, проблема инсульта до сих пор является актуальной ввиду тяжести заболевания. Следствием ОНМК в большинстве случаев являются утрата трудоспособности и инвалидизация пациентов. Так, постинсультная деменция наблюдается у 7—23% больных, когнитивные расстройства — у 35—47%. Утрачивается трудоспособность у 70—80% пациентов, выживших после инсульта, причем примерно 20—30% из них нуждаются в постоянном уходе [3, 4].

В основе патогенеза ишемического (ИИ) и геморрагического (ГИ) инсульта лежат разные этиопатогенетические механизмы, но в любом случае в ткани, подвергнутой ишемии, возникает реактивное воспаление [5, 6]. Этот процесс имеет двойственное биологическое значение. С одной стороны, он направлен на отграничение патологического очага ишемизированной ткани с последующим устранением, с другой — он может провоцировать вторичное повреждение. Развитие выраженного воспаления при ишемии запускается массивной продукцией провоспалительных цитокинов, активацией микроглии с вовлечением клеток врожденного иммунитета [7, 8]. Известно, что нейтрофилы первыми устремляются в очаг ишемизированной ткани головного мозга, где они реализуют механизмы противобактериальной защиты, но при этом секретируют протеазы, являющиеся одной из причин гибели нейронов [9, 10]. Функциональная активность нейтрофилов также характеризуется состоянием их респираторного взрыва, который развивается при взаимодействии клеток с объектами фагоцитоза и интегрально характеризует уровень самого фагоцитоза и активность механизмов внешнего киллинга [11—13].

Активация воспалительных процессов при инсульте тесно связана с изменениями в гемостазе. Неудивительно, что при этом устанавливаются значительные изменения в свертывающей и противосвертывающей активности крови [14, 15]. Взаимодействие нейтрофилов и гемостаза реализуется различными механизмами: контактным (формирование агрегатов) и гуморальным (сигнальные коммуникации при участии различных биологически активных веществ) путем [16, 17]. Однако особенности связи между функциональной активностью нейтрофилов и показателями гемостаза при ИИ и ГИ до сих пор мало изучены.

Цель исследования — изучение связи между состоянием респираторного взрыва нейтрофилов и показателями гемостаза у больных ИИ и ГИ.

На базе Красноярской межрайонной клинической больницы № 20 им. И.С. Берзона (Красноярск) были обследованы 33 больных ИИ (17 женщин и 16 мужчин, средний возраст 51,8±0,6 года) и 31 пациент с ГИ (16 женщин и 15 мужчин, средний возраст 50,4±0,7 года) в первые 24 ч после развития ОНМК. Диагноз ОНМК был подтвержден нейровизуализационными методами исследования: компьютерной (КТ) и магнитно-резонансной (МРТ) томографией. Группу контроля составили 53 здоровых (28 женщин и 25 мужчин аналогичного возрастного диапазона).

Критериями включения в исследование явились: возраст до 60 лет; диагноз ОНМК, подтвержденный методом КТ и/или МРТ, атеротромботический, кардиоэмболический или лакунарный варианты ИИ, ГИ; обращение пациента за медицинской помощью в 1-е сутки от начала заболевания. Критериями невключения в исследование были: наличие злокачественных новообразований; острые воспалительные заболевания и хронические в стадии обострения; использование тромболитических препаратов и антикоагулянтов.

Степень тяжести неврологических нарушений у пациентов с ОНМК определяли по шкале инсульта Национального института здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale — NIHSS). Нейтрофилы выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности (ρ) фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см³ для отделения лимфоцитов; ρ=1,119 г/см³ для выделения нейтрофилов. Состояние респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа [11]. В качестве индикаторов хемилюминесценции использовали люминол и люцигенин. Оценка спонтанной и зимозаниндуцированной хемилюминесценции осуществлялась в течение 90 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе БЛМ-3607 (ООО «МедБиоТех», Красноярск). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Т_max), максимальное значение интенсивности (I_max), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной хемилюминесценции (S_инд) к площади спонтанной (S_спонт) и определяли как индекс активации (S_инд/S_спонт).

У всех пациентов исследовали следующие показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза: агрегацию тромбоцитов (спонтанную и индуцированную) с применением в качестве индукторов аденозиндифосфата (АДФ) в дозах 0,1 и 5 мкМ и адреналина в дозе 10 мкг/мл на агрегометре LA230−2 («БИОЛА», Россия). Количество тромбоцитов в крови определялось с помощью гематологического анализатора Sysmex XP-300 («Sysmex Corp.», Япония). На анализаторе гемостаза STA Compact («Roche Diagnostics», Швейцария) определялась концентрация фактора фон Виллебранда (ФВ) в плазме крови. Также с помощью этого анализатора исследовались следующие показатели плазменного гемостаза: содержание фибриногена, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), уровень D-димера, тромбиновое время (ТВ), уровни растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и антитромбина III (АТ-III).

Все пациенты подписали информированное согласие. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава России № 266 от 19.06.03.

Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 («StatSoft Inc.», США, 2007). Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха ([Q₂₅; Q₇₅]). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни. Для исследования силы связей показателей вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену (r).

Исследование люцигенинзависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови у пациентов с ИИ и ГИ позволило установить, что при спонтанной и зимозаниндуцированной хемилюминесценции у больных снижалось Т_max активности (табл. 1).

При исследовании показателей люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов выявили, что I_max спонтанной хемилюминесценции у больных с ИИ и ГИ был повышен относительно контрольных значений (табл. 2).

Респираторный взрыв фагоцитирующих клеток определяется уровнем синтеза первичных и вторичных активных форм кислорода (АФК) [12, 18]. Люцигенинзависимая хемилюминесценция характеризует уровень и кинетику синтеза супероксид-радикала (относится к первичным АФК), тогда как интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции определяется уровнем синтеза и первичных, и вторичных АФК [18, 19]. Причем синтез супероксид-радикала в клетках осуществляется НАДФН-оксидазой. При оценке хемилюминесцентной активности нейтрофилов было установлено, что у больных с ИИ и ГИ снижалось T_max НАДФН-оксидазы в случае спонтанного и индуцированного респираторного взрыва нейтрофилов. Величина T_max характеризует время от момента воздействия регуляторного и/или антигенного воздействия до максимальной активации ферментов, синтезирующих АФК [18]. В настоящем исследовании уровень индуцированного синтеза супероксид-радикала повышался только у пациентов с ИИ.

У больных с ИИ и ГИ увеличивался уровень спонтанного и индуцированного синтеза нейтрофилами всех типов АФК, что определялось с помощью люминолзависимой хемилюминесценции. При этом у больных с ГИ выявлялся более высокий показатель спонтанного синтеза АФК клетками по сравнению с аналогичным показателем респираторного взрыва у больных с И.И. Также у них наблюдался меньший уровень индукции синтеза АФК, чем при ИИ, что характеризовалось меньшей величиной индекса активации по люминолзависимой хемилюминесценции. Следовательно, респираторный взрыв нейтрофилов крови при ГИ характеризуется более выраженным уровнем синтеза вторичных АФК, но при снижении метаболических ресурсов. Необходимо отметить, что именно вторичные АФК обладают более высоким уровнем бактерицидной и провоспалительной активности [20, 21].

Исследование состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза позволило установить, что только у больных с ГИ относительно контрольного диапазона повышается уровень спонтанной и стимулированной АДФ в дозе 0,1 мкМ агрегации тромбоцитов (табл. 3).

Таким образом, изменения состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза выявлялись только при ГИ, что определялось ростом спонтанной и АДФ-индуцированной (0,1 мкМ) агрегации тромбоцитов. В то же время изменения коагуляционного гемостаза были установлены и у больных с ИИ, и у пациентов с ГИ. В целом у больных обоими типами инсульта при повышении концентрации фибриногена было обнаружено увеличение антикоагуляционной и фибринолитической активности, что в свою очередь влияло на рост ТВ и АЧТВ (только у больных с ГИ). Однако у больных с ГИ была более выражена фибринолитическая активность, чем при ИИ.

С помощью корреляционного анализа исследовали связи между показателями гемостаза и параметрами респираторного взрыва нейтрофилов. Было обнаружено, что у здоровых (контрольная группа) уровень стимулированной агрегации тромбоцитов был отрицательно связан с T_max зимозаниндуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов (r= –0,64, р=0,044), тогда как АЧТВ положительно коррелировало с T_max спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции (r=0,66, р=0,039).

У больных с ИИ уровень стимулированной АДФ в дозе 0,1 мкМ агрегации тромбоцитов был отрицательно связан с I_max (r= –0,47; р=0,020) и S (r= –0,46; р=0,025) спонтанной люцигенинзависимой хемилюминесценции нейтрофилов, а также положительно — с индексом активации по люцигенинзависимой хемилюминесценции (r=0,46; р=0,025). С S спонтанной люцигенинзависимой хемилюминесценции также отрицательно коррелировал уровень адреналининдуцированной агрегации (r= –0,42; р=0,043). Кроме того, у пациентов с ИИ наблюдались связи показателей коагуляционного гемостаза с параметрами респираторного взрыва нейтрофилов: ТВ с I_max спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции (r= –0,56; р=0,038) и уровень АТ-III с индексом активации по люминолзависимой хемилюминесценции (r=0,68; р=0,015).

При ГИ обнаружили, что уровень стимулированной АДФ в дозе 0,1 мкМ агрегации тромбоцитов был отрицательно связан с I_max (r= –0,62; р=0,030) и S (r= –0,58; р=0,049) зимозаниндуцированной люцигенинзависимой хемилюминесценции нейтрофилов. У пациентов c ГИ величина протромбинового индекса (ПТИ) и уровень АЧТВ отрицательно коррелировали соответственно с T_max (r= –0,79; р=0,036) и I_max (r= –0,68; р=0,042) индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов. Кроме того, T_max спонтанной люцигенинзависимой хемилюминесценции было положительно связано с ТВ (r=0,76; р=0,049) и отрицательно — с АТ-III (r= –0,81; р=0,027).

Следовательно, наименее выраженная связь между показателями респираторного взрыва нейтрофилов и гемостаза выявлялась у здоровых контрольной группы, что определялось зависимостью АЧТВ от T_max спонтанного синтеза общих АФК (положительная) нейтрофилами и уровня адреналининдуцированной агрегации тромбоцитов от T_max индуцированного синтеза также общих АФК (отрицательная). У больных с ИИ показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза коррелировали только с хемилюминесцентными параметрами синтеза первичных АФК, тогда как показатели коагуляционного гемостаза были связаны только с параметрами синтеза нейтрофилами общих АФК.

Исходя из результатов корреляционного анализа, можно заключить, что у больных с ИИ активность НАДФН-оксидазы находилась в обратной зависимости к уровням АДФ- и адреналининдуцированной агрегации тромбоцитов. Уровень метаболических резервов (индекс активации) для синтеза супероксид-радикала в нейтрофилах положительно коррелировал с АДФ-зависимой агрегацией тромбоцитов. В то же время интенсивность синтеза всех АФК отрицательно коррелировала с временем формирования фибринового сгустка, а индекс активации по люминолзависимой хемилюминесценции был положительно связан с содержанием АТ-III.

У больных с ГИ активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов также была отрицательно связана с уровнем АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. При этом с показателями коагуляционного гемостаза у данных пациентов коррелировали параметры и люцигенин-, и люминолзависимой хемилюминесценции. Причем в данной системе связей со стороны параметров респираторного взрыва нейтрофилов играли роль кинетические показатели — T_max спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Так, время активации НАДФН-оксидазы в нейтрофилах у больных c ГИ было положительно связано с ТВ и отрицательно — с антикоагуляционной активностью плазмы. T_max синтеза всех АФК отрицательно коррелировало с ПТИ, как и T_max индуцированного синтеза — с АЧТВ.

Таким образом, у больных с инсультами наблюдалось изменение кинетики и активности респираторного взрыва нейтрофилов крови. Особенности кинетики респираторного взрыва нейтрофилов заключались в замедлении синтеза первичных АФК при сохранении скорости синтеза вторичных АФК. Рост активности респираторного взрыва определялся увеличением интенсивности синтеза только вторичных АФК, обладающих выраженной бактерицидной и провоспалительной активностью. При этом у больных с ГИ выявлялся более высокий (по сравнению с аналогичными показателями больных с ИИ) уровень спонтанного и индуцированного синтеза вторичных АФК, но при снижении метаболических ресурсов для их синтеза. Только при ГИ была обнаружена активация спонтанной и АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Со стороны коагуляционного гемостаза было установлено, что у больных с инсультами на фоне увеличения концентрации фибриногена увеличивалась антикоагуляционная и фибринолитическая активность. У больных с ГИ выявлялся более высокий уровень фибринолитической активности по сравнению с показателями больных с ИИ. С помощью корреляционного анализа было установлено, что у больных с инсультами уровень синтеза первичных АФК находился в отрицательной зависимости к уровням индуцированной агрегации тромбоцитов. У больных с ГИ выявились положительные связи между кинетическими параметрами свертывания крови и синтеза первичных АФК, тогда как интенсивность синтеза всех АФК отрицательно коррелировала с АЧТВ. В целом можно сделать заключение о более выраженной синергической зависимости между респираторным взрывом нейтрофилов (провоспалительная активность) и коагуляционным гемостазом при ГИ по сравнению с выявленным при с ИИ.

Полученные результаты свидетельствуют о взаимодействии гемостаза и нейтрофилов в патогенезе инсультов и определяют необходимость учитывать выявленные механизмы при проведении противовоспалительной, антиагрегантной и антикоагулянтной терапии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: aasavchenko@yandex.ru