Устойчивость мозга к дефициту кровоснабжения может повышаться под действием коротких эпизодов ишемии/реперфузии или гипоксии [1], кратковременной гипотермии [2] и других умеренных стрессорных влияний, способных активировать эндогенные защитные механизмы и повышать устойчивость ткани к последующей тяжелой ишемии [3—5]. Этот феномен получил название прекондиционирования. Активация аденозинтрифосфатзависимых калиевых (К⁺_АТФ) каналов рассматривается как основной компонент ответа в моделях прекондиционирования [3]. Снижение уровня АТФ во время ишемии ведет к открытию К⁺_АТФ-каналов плазматической мембраны, роль которых сводится к восстановлению низкой концентрации ионов Na⁺ и Са²⁺ в цитозоле и предотвращению деполяризации. Активация К⁺_АТФ-каналов внутренней мембраны митохондрий связана с предотвращением перегрузки митохондрий ионами Са²⁺ [6]. Ведущая роль в развитии прекондиционирования отводится митохондриальному пулу [7].

Роль оксида азота (NO) в развитии ишемического повреждения клеток не менее важна. Характер действия NO зависит от интенсивности его продукции, локализации и состояния окружающей ткани. Гиперпродукция NO при ишемическом инсульте (ИИ) вызывает повреждения структурных и регуляторных компонентов клеток [8], а связывание NO c ферментами транспортной цепи митохондрий ингибирует клеточное дыхание [9]. Умеренная активация системы NO во время прекондиционирования может оказывать нейропротективное действие, активируя ферменты антиоксидантной системы, запуская антиапоптотические механизмы и увеличивая мозговой кровоток [8]. Защитное действие умеренной продукции NO также может быть опосредовано и активацией К⁺_АТФ-каналов [10].

Увеличение локального мозгового кровотока после гипоксического/ишемического прекондиционирования (ИП), вероятно, может иметь место только в первую раннюю фазу прекондиционирования. В первые часы после гипоксического прекондиционирования происходит централизация кровообращения. Существенную роль в адаптивном ответе сосудов мозга, вызванную дефицитом кислорода, играет компенсаторное увеличение экстракции кислорода из венул [11]. В последующем через несколько суток ИП никак не сказывается на базальном уровне кровотока в коре мозга [12—14]. В то же время ИП влияет на скорость восстановления кровотока в зоне пенумбры после окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА), что вносит свой вклад в реализацию защитного эффекта прекондиционирования [15].

Цель исследования — изучение роли АТФ-зависимых калиевых (К⁺_АТФ) каналов в реализации нейропротективного эффекта ИП и фармакологического прекондиционирования (ФП) и оценка динамики уровня метаболитов NO крови в условиях ишемии головного мозга.

Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс (n=86, массой 300—500 г). Исследование осуществляли в соответствии с требованиями биоэтической комиссии МГУ имени М.В. Ломоносова. В рамках исследования проведено два экспериментальных этапа (табл. 1). На первом этапе изучали влияние блокады К⁺_АТФ-каналов (глибенкламид) на размер ишемического поражения (I серия); защитный эффект отсроченной фазы ИП (II серия); возможность фармакологического моделирования (диазоксид) эффектов прекондиционирования активацией К⁺_АТФ-каналов (III серия).

На втором этапе изучали влияние ишемии головного мозга на компоненты системы NO: измеряли уровень метаболитов NO у экспериментальных животных I—III серий, а также влияние ОСМА на содержание гемоглобинсвязанного NO венозной крови (Hb-NO) у крыс IV экспериментальной серии.

Моделирование ИИ.В I—IV сериях эксперимента ИИ моделировали под общей анестезией хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно) по усовершенствованной методике с электрокоагуляцией фронтальной ветви СМА и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии [16—18].

Моделирование феномена прекондиционированияИП головного мозга во II серии эксперимента выполняли за 24 ч до ОСМА путем попеременного пережатия правой и левой общих сонных артерий на 5 мин с 5-минутной реперфузией в течение 1 ч. ФП головного мозга проводили в III серии путем внутрижелудочкового введения 10 мкл 6 мМ раствора неселективного активатора К⁺_АТФ-каналов диазоксида («Sigma») в правый боковой желудочек головного мозга (AP — 1,0 мм, L 2 мм, V — 4,5 мм) за 24 ч до ОСМА. Предварительную блокаду К⁺_АТФ-каналов в I и II сериях осуществляли с помощью глибенкламида в дозе 20 мг/кг.

Оценка тяжести ишемического поражения.ВI—III сериях размер некроза определяли как процент пораженной ткани к общей площади коры полушария в срезах мозга толщиной 1—2 мм, окрашенных 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом.

Определение содержания NO и его метаболитов в сыворотке венозной крови.Уровень нитратов (NO₃^–) и нитритов (NO₂^–) измеряли в сыворотке венозной крови, взятой у животных I—III серий за неделю до моделирования фокальной ишемии, затем через 5, 24 и 72 ч после ОСМА. NO₃— восстанавливали до NO₂^– хлоридом ванадия (III); суммарную концентрацию определяли цветной реакцией Грисса. Оптическую плотность растворов измеряли с помощью спектрофотометра Multiskan EX Primary EIA V 2.1−0 при длине волны 492 нм.

Измерение содержания гемоглобинсвязанного NO (Hb-NO) у животных IV серии выполнено методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на спектрометре Bruker ER 200E SRC в Х диапазоне (9,50 ГГц) при температуре 77^о К [19]. В образцах венозной крови выявляли два типа парамагнитных комплексов: комплексы NO с гемом гемоглобина, расположенные в разных плоскостях, R- и T-конформеры.

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакетов программ Excel 2010, SPSS 17.0 и Statistica 8.0. Данные представлены в виде средних значений (M)±стандартного отклонения (σ). При исследовании связей внутри зависимых выборок использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r). Для сравнения зависимых выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона. При сравнении двух независимых выборок использовали непараметрический критерий Манна—Уитни (U-критерий) и критерий Фишера. Различия признавались значимыми при допустимой вероятности ошибки менее 0,05.

Роль К⁺_АТФ-каналов в реализации нейропротективного эффекта прекондиционирования.Результаты I этапа исследования представлены в табл. 2. В условиях острой ишемии головного мозга блокада К⁺_АТФ-каналов глибенкламидом (I серия, Глиб) не оказала влияния на размер зоны поражения. ИП, выполненное за 24 ч до ОСМА (II серия, ИП), достоверно уменьшило размер зоны инфаркта на 37%. В группе крыс, получавших глибенкламид (II серия, ИП+Глиб) за 30 мин до ИП размер зоны некроза был сравним с таковым у контрольных животных и статистически значимо выше, чем у крыс с И.П. Активация К⁺_АТФ-каналов диазоксидом за 24 ч до ОСМА (III серия, ФП) привела к развитию защитного эффекта аналогичного ИП головного мозга.

Влияние активации и ингибирования К⁺_АТФ-каналов на суммарное содержание NO₃^– и NO₂^– в крови крыс с ИИ.Для всех групп наблюдали общую динамику изменения суммарной концентрации NO₃^– и NO₂^– в сыворотке венозной крови (см. табл. 2): через 5 ч после ОСМА в группах контроля (I и II серии) наблюдали статистически значимое увеличение концентрации NO₃^– и NO₂^– (см. рисунок); к 24 ч и 3-м суткам после моделирования ИИ концентрация приближалась к фоновой, или была ниже фоновых значений (III серия). Анализ межгрупповых различий выявил связь между ингибированием К⁺_АТФ-каналов глибенкламидом за 30 мин или 24 ч до ОСМА и пониженной концентрацией NO₃^– и NO₂^–, вне зависимости от проведения у них прекондиционирования (I серия, Глиб; II серия, ИП+Глиб). Активация К⁺_АТФ-каналов диазоксидом не повлияла на уровень NO₃^– и NO₂^– в сыворотке крови (III серия, ФП).

Среди контрольных групп анализ связи между суммарной концентрацией метаболитов NO и размером области ишемического поражения выявил обратную корреляцию. Животные с наименьшим размером зоны некроза имели высокий уровень NO₃^– и NO₂^– через 72 ч после ОСМА (r= –0,556; p=0,003). Однако у крыс, получавших глибенкламид (группы Глиб и ИП+Глиб), наблюдали прямую зависимость — наибольший размер зоны некроза сопровождался высокими концентрациями NO₃^– и NO₂^– через 24 ч после ИИ (r=0,529; p=0,024). В группах животных с ИП или ФП корреляционный анализ не выявил каких-либо значимых связей.

Динамика изменения содержания Hb-NO в крови. В крови крыс с ИИ через 24 ч после ОСМА отметили повышение уровня R-конформера комплексов Hb-NO на 42% (см. рисунок), статистически значимых отличий от группы интактных животных не выявлено (p=0,078). Для Т-конформера комплексов Hb-NO в крови контрольных животных наблюдали обратную ситуацию (см. рисунок) — через 24 ч после ОСМА их уровень был на 75% меньше, чем у интактных животных (p=0,043).

В качестве наркоза использовали хлоралгидрат — препарат алифатического ряда с продолжительным действием. Этот наркоз не обладает нейропротективным действием и позволяет адекватно оценить влияние исследуемых веществ на размер поражения. Использованная модель ИИ у крыс стабильно воспроизводится, высота окклюзии СМА на уровне фронтальной ветви подобрана так, чтобы некроз развивался в лобно-теменной части коры, не затрагивая подкорковые структуры, что позволяет избежать осложнений со стороны висцеральных функций и гибели животных. Одновременная коагуляция подходящей к СМА вены и перевязка ипсилатеральной сонной артерии стабилизирует размер зоны некроза и позволяет уменьшить число животных в эксперименте.

В работе использовали неселективный блокатор К⁺_АТФ-каналов плазматической мембраны и митохондриальных К⁺_АТФ-каналов глибенкламид, в дозе 20 мг/кг, и активатор тех же типов каналов диазоксид, для введения оба препарата были растворены в ДМСО, дозы и время инъекции подобраны на основе данных литературы [20, 21]. Выбор неселективных препаратов обусловлен тем, что в условиях ишемии в клетках активируются оба типа К⁺_АТФ-каналов. Мы исходили из предположения о том, что на активность различных видов NO-синтазы в первую очередь может оказывать влияние состояние К⁺_АТФ-каналов плазматической мембраны, в то время как на состояние нитритредуктазных систем митохондрий и митохондриальной NO-синтазы — состояние митохондриальных К⁺_АТФ-каналов. Задачей было оценить комплексный вклад К⁺_АТФ-каналов в регуляцию содержания в организме экспериментальных животных NO и его метаболитов.

Все эксперименты выполнены через 24 ч после ИП, в этой временной точке его эффект максимален [3]. Введение глибенкламида за 30 мин до ОСМА не влияло на размер зоны некроза, следовательно, в условиях ИИ блокада как клеточных, так и митохондриальных К⁺_АТФ-каналов не важна для формирования поражения, а сам препарат в нашем эксперименте устраняет эффекты И.П. Модель Ф.П. с внутрижелудочковым введением диазоксида была выбрана как одна из наиболее эффективных и воспроизводимых, поскольку лишь пятая часть циркулирующего в крови диазоксида способна преодолеть гематоэнцефалический барьер (отношение мозг/плазма — 0,20) и оказать прямое действие на К⁺_АТФ-каналы клеток головного мозга [22, 23].

Уровень NO₃^–, NO₂^– и Hb-NO измеряли в сыворотке венозной крови через 5, 24 и 72 ч после ОСМА. Сроки исследования выбраны с учетом активности конститутивных и индуцибельной NO-синтаз при развитии ИИ: 5 ч охватывают период работы только конститутивных NO-синтаз, а 24- и 72-часовые периоды позволяют оценить активность индуцибельной NO-синтазы [24].

Оценка размера зоны некроза после прекондиционирования, проведенного за 24 ч до моделирования ИИ, продемонстрировала одинаковый по величине протективный эффект ИП и Ф.П. Предварительное введение глибенкламида нивелировало защитный эффект ИП, что свидетельствует о ключевой роли К⁺_АТФ-каналов в реализации защитных эффектов отсроченной фазы прекондиционирования на головной мозг крыс.

Анализ результатов измерения NO₃^– и NO₂^–, а также комплексов Hb-NO в крови крыс с ИИ выявил сходную динамику. В первые 5 ч после ОСМА наблюдали снижение уровня Hb-NO, находящегося в R-конформации, доля которого в норме составляет около 90% от общего количества комплексов Hb-NO. В условиях пониженного содержания кислорода в ткани, а также при действии ряда других регуляторных факторов (2,3-дифосфоглицерат, ацидоз, гиперкапния), часть R-конформеров комплексов Hb-NO может освобождаться от связанного с гемоглобином кислорода и переходить в T-конформеры, которые значительно слабее удерживают лиганд NO [25—27]. Освободившийся NO может окисляться до NO₃^– и NO₂^–, при этом мы наблюдали закономерное увеличение их концентрации в крови экспериментальных животных параллельно уменьшению концентрации R-конформеров гемоглобина. Таким образом, комплексы Hb-NO, находящиеся в R-конформации, могут одновременно выполнять функции депо и переносчика, а при выполнении R→T- перехода в условиях ишемии — донора NO, высвобождение которого может оказывать регуляторное действие. Мы не исключаем возможность повышения концентрации NO₃^– и NO₂^– за счет активной работы эндотелиальной NO-синтазы, активирующейся при ишемии. К 1-м суткам после экспериментального ИИ наблюдали нормализацию уровня NO₃^– и NO₂^–. Тем временем ситуация с уровнем комплексов Hb-NO кардинально изменилась: преобладали R-конформеры, а содержание в крови T-конформеров достигло минимума. Подобный T→R-переход можно объяснить как восстановлением накопленных NO₃^– и NO₂^– до NO с последующим формированием комплексов Hb-NO, так и активацией индуцибельной NO-синтазы, в первую очередь в области повреждения.

Через 72 ч после ОСМА в крови животных наблюдали нормализацию содержания комплексов Hb-NO, очередной R→T-переход, а следовательно, и высвобождение молекул NO. Концентрация NO₃^– и NO₂^– при этом не отличалась от фоновой. Корреляционный анализ выявил обратную зависимость между повышенным уровнем NO₃^– и NO₂^– в сыворотке крови контрольных животных на 3-и сутки после ИИ и размером области поражения. Полученный результат косвенно указывает на нейропротективный эффект умеренной продукции NO в сосудистом русле в период формирования зоны ишемического некроза, что может быть связано с NO-опосредованной вазодилатацией и улучшением коллатерального кровообращения [8].

В группе животных, которым вводили глибенкламид, корреляция между размером зоны некроза и сывороточной концентрацией NO₃^– и NO₂^– через сутки после ОСМА была прямой. По данным литературы, в клетках микроглии при воспалении увеличивается экспрессия К⁺_АТФ-каналов [28], а воздействие глибенкламида значительно усиливает степень активации микроглиальных клеток, что приводит к повышению продукции цитокинов, NO и активных форм кислорода (АФК) [29]. Избыточная продукция АФК на фоне генерации NO индуцибельной NO-синтазой и последующее включение NO в свободнорадикальные реакции могут объяснить снижение концентрации NO₃^– и NO₂^– через сутки после ИИ у крыс, которым перед ОСМА вводили глибенкламид. Молекула NO является слабым нитрозилирующим агентом, однако активность NO в значительной степени повышается при образовании более агрессивных соединений, в том числе и с супероксидом [30], а также в реакциях с сульфгидрильными радикалами, генерирующимися при окислении тиолов [31]. Возможно, это приводит к тому, что часть молекул NO не окисляется до малотоксичных NO₃^– и NO₂^–, а формируются комплексы с компонентами клеток [32]. Последствием является повреждение клеток и их гибель в зоне воспаления. Для дальнейшей конкретизации механизмов наблюдаемых изменений требуется специальное исследование.

Таким образом, К⁺_АТФ-каналы занимают одну из ключевых позиций в развитии защитных эффектов прекондиционирования на головной мозг крыс с ишемическим поражением. Помимо участия в процессах прекондиционирования, К⁺_АТФ-каналы, по-видимому, занимают особое место в регуляции интенсивности процессов микроглиального воспаления в ишемизированной ткани. Исследование динамики изменения уровня метаболитов NO в крови дает лишь косвенное представление о реальных процессах, стоящих за регуляцией продукции этой короткоживущей молекулы. Более полное представление дает комплексный анализ компонентов системы NO, который предполагает использование концепции депонирования NO белками крови. Связь между системами К⁺_АТФ-каналов и NO на клеточном и субклеточном уровнях, а также механизмы регуляции содержания свободного NO в кровеносном русле требуют дальнейшего изучения.