Кататоническая ригидность хвоста как биологическая реакция мышей на подкожное введение морфина впервые была описана в начале прошлого века. В. Штраубом (W. Straub, 1911 г. [1]). Было отмечено сильное загибание хвоста в положение, почти параллельное позвоночнику, а годом позже были описаны беспокойство и рефлекторная возбудимость, связанные с введением морфина, а также паралич задних конечностей, лордоз позвоночника и S-образный изгиб хвоста у мышей [2]. Некоторое время появление реакции Штрауба^​1​᠎ объясняли спазмом сфинктеров (m. sphincter vesicae и m. sphincter ani externus), пока не было установлено, что анатомической основой феномена является сокращение m. sacrococcygeus dorsalis. При оценке участия нервной системы в регуляции реакции Штрауба было показано, что ее выраженность зависит от степени разрушения серого вещества среднего мозга, тогда как разрушение более высоких отделов ЦНС при сохранности среднего мозга не препятствует ее появлению [3]. Было также обнаружено, что перерезка спинного мозга на нижнем уровне грудного или поясничного сегментов устраняет рассматриваемую реакцию, а у мышей с уже перерезанным спинным мозгом в данных отделах инъекция морфина не вызывает поднимания хвоста.

В экспериментальной практике реакцию Штрауба у мышей используют в качестве быстрого и простого скринингового теста для оценки потенциальных аддиктивных свойств новых обезболивающих средств [4]. В то же время известно, что повышение мышечного тонуса, изменение позы и разгибание или отведение задних конечностей также наблюдаются у животных при развитии серотонинового синдрома, спровоцированного введением прямых или непрямых агонистов 5-HT-рецепторов, в том числе ингибиторами МАО, прекурсорами серотонина и препаратами, влияющими на его высвобождение [5, 6], а антагонисты 5-HT-рецепторов оказывают ингибирующее действие на реакцию Штрауба, вызванную введением морфина [7]. Способность вызывать эту реакцию отмечена также у специфического агониста дофаминовых рецепторов апоморфина, причем данная реакция может быть подавлена предварительным введением антагонистов D1- или D2-рецепторов [8]. Существует мнение, что реакция Штрауба, вызванная введением морфина, может также быть опосредована активацией центральных D2-рецепторов и, в меньшей степени, α-адренорецепторов [9].

Реакция Штрауба, не обусловленная введением фармакологических средств, предлагается к использованию в качестве поведенческого индекса, отражающего эндогенный выброс эндорфинов. Было показано, что стресс кратковременного форсированного плавания в холодной воде вызывает подъем хвоста у крыс Sprague—Dawley, причем эта реакция зависит от длительности пребывания в воде и подавляется введением антагониста опиатных рецепторов налоксона [10]. Подъем хвоста выше уровня спины происходит также у мышей и крыс в условиях агонистического взаимодействия [11] и новизны обстановки [10].

Кроме этого, уже длительное время классическую реакцию Штрауба используют для сравнительной оценки потенциальных миорелаксантов [12, 13], при этом в отличие от других методов с использованием кошек и крыс отмечают высокий уровень корреляции результатов, полученных на данной модели, и клинических данных [14]. Несмотря на очевидные преимущества этой простой в исполнении модели с хорошей повторяемостью оцениваемой реакции, получаемые результаты бывает трудно сопоставить из-за значительных различий способов индукции (используются дозы морфина от 10 до 120 мг/кг), анализа данных (качественной или количественной оценки), «масштаба» оценочных шкал.

Цель настоящего исследования — отработка и фармакологическая валидация реакции Штрауба для сравнительной оценки антиспастического эффекта серотонинергических соединений. Возможность их успешного применения при спастических состояниях была показана в недавних клинических исследованиях.

В экспериментах использовали самцов мышей весом 22—35 г (питомник «Рапполово», Санкт-Петербург). Животных содержали группами по 8—12 особей в клетках TIII (425×266×185 мм, «Tecniplast», Италия) на беспылевой древесной стружке («Tierwohl, JRS GMBH+Co», Германия) в помещениях с контролируемыми условиями: температура воздуха — 21±1 °C; влажность — 50±20%; световой цикл — 12 ч свет/12 ч темнота (включение света в 08:00). Животные имели неограниченный доступ к стандартному полнорационному комбикорму (ПК 120−1, «Лабораторснаб», Москва) и фильтрованной (UAPHOR, Санкт-Петербург) водопроводной воде, за исключением времени проведения тестов. Основания клеток, подстилочный материал и бутылочки с водой меняли 2 раза в неделю. После выполнения тестов проводили эвтаназию животных в камере с CO2.

Морфина гидрохлорид (Московский эндокринный завод, Россия) растворяли в стерильном 0,9% изотоническом растворе NaCl и вводили подкожно непосредственно перед тестом. Баклофен (3, 6 и 10 мг/кг; «Sigma-Aldrich Со.», США) и дантролен натрия (20, 30, 60 и 100 мг/кг; «Merz Pharmaceuticals GmbH», Германия) вводили подкожно за 30 мин до инъекции морфина. Действие тизанидина гидрохлорида (0,2, 0,3, 0,6 и 1 мг/кг; «Merz Pharmaceuticals GmbH», Германия) оценивали после подкожного введения за 20 мин до инъекции морфина^​2​᠎. Ципрогептадина гидрохлорида сесквигидрат (1, 3 и 10 мг/кг; «Sigma-Aldrich Со.», США) и метисергида малеат (1, 3 и 5,6 мг/кг; «Sigma-Aldrich Со.», США) вводили внутрибрюшинно за 30 мин до инъекции морфина. Растворы всех веществ изготовляли в день теста и вводили из расчета 10 мл/кг. В качестве растворителя для баклофена, тизанидина и метисергида использовали 0,9% изотонический раствор NaCl, для ципрогептадина — дистиллированную воду, для дантролена Na — 2% водный раствор Tween 80.

Для оценки выраженности реакции Штрауба мышей помещали в индивидуальные прозрачные TII клетки (230×170×140 мм, «Тecniplast», Италия). Выраженность реакции оценивали каждые 3 мин в течение 30—60 мин после введения морфина. Наблюдатель, не знавший полученные животными дозы препаратов, отмечал интенсивность реакции (угол подъема хвоста по отношению к горизонтальной поверхности, рис. 1) по модифицированной шкале, предложенной T. Kameyama и соавт. [15]. Эта шкала имеет следующие градации: 0 баллов — менее 30°; 1 балл — 30—45°; 2 балла — 46—90°; 3 балла — более 90°; 4 балла — S-образный изгиб хвоста, заваленного на спину.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета статистических программ SPSS (версия 16, США). Выполняли дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим сравнением. Различия считали значимыми при p<0,05.

С целью подбора оптимальных условий для исследования антиспастического действия фармакологических средств была выполнена серия тестов по определению дозо- и времязависимости действия морфина на выраженность реакции Штрауба. Морфин вводили подкожно в дозах 10, 20, 40 и 60 мг/кг и далее реакцию оценивали каждые 3 мин в течение 1-го часа (рис. 2). Дисперсионный анализ с фиксированным фактором «доза морфина» и фактором повторных измерений «временной интервал» выявил значимый эффект дозы (F(3,29)=27,9, p<0,0001), интервала (F(9,260)=53,2, p<0,0001), а также взаимодействия этих факторов (F(26,260)=2,1, p=0,007). Максимальную выраженность реакции Штрауба наблюдали через 15—30 мин после введения морфина (см. рис. 2), на основании чего был выбран 30-минутный интервал (10 наблюдений) для оценки эффектов фармакологических средств. В минимальной из доз (10 мг/кг), которую часто используют для качественной оценки эффектов фармакологических средств на реакцию Штрауба, морфин вызывал у мышей подъем хвоста на уровень около 45° (1—2 балла по оценочной шкале), т. е. сходный с таковым у стрессированных животных в условиях социальной конфронтации [11], форсированного плавания в холодной воде или новизны обстановки [10]. Максимальную выраженность реакции Штрауба наблюдали после введения морфина в дозах 40 и 60 мг/кг, не обнаружили различий в интенсивности реакции у животных, получавших морфин в данных дозах. В связи с этим для дальнейших тестов была выбрана доза морфина 40 мг/кг, вызывающая значимо более выраженную реакцию, чем при активации эндогенной опиоидной системы.

Использованные в настоящей работе миорелаксанты относятся к основным лекарственным средствам, применяемым для лечения спастичности [16]. Эти вещества представляют собой как миорелаксанты центрального действия, влияющие на синаптическую передачу возбуждения в центральной нервной системе, так и периферического действия, угнетающие прямую возбудимость поперечно-полосатых мышц. Так, агонист ГАМКВ-рецепторов баклофен не способен блокировать пирамидные и парапирамидные влияния, он снижает степень растяжения мышечных веретен за счет изменения импульсации от γ-мотонейронов и показан преимущественно при болезненных сгибательных спазмах. Дантролен препятствует высвобождению кальция из саркоплазматического ретикулума мышечных волокон, снижая его внутриклеточную концентрацию, и, таким образом, уменьшая спастичность за счет увеличения мышечной слабости. Тизанидин, стимулятор α2-адренорецепторов, предотвращает выброс возбуждающих нейромедиаторов, подавляя полисинаптическое возбуждение интернейронов спинного мозга. Обычно его применяют в случае неэффективности бензодиазепинов, баклофена и дантролена, например при поражениях мотонейронов и инсультах.

Баклофен, вводимый за 30 мин до инъекции морфина в дозе 40 мг/кг, уменьшал интенсивность реакции Штрауба (рис. 3, а) во всех использованных дозах (3, 6 и 10 мг/кг). Дисперсионный анализ выявил значимый эффект фактора «доза» (F(3,36)=26,0; p<0,001), «интервал» (F(7,251)=71,9; p<0,001), а также взаимодействия этих двух факторов (F(21,251)=4,1; p<0,001). Однако в использованном диапазоне доз баклофен значимо подавлял двигательную активность мышей (см. также [13]). Известно, что дозы баклофена, в которых он подавляет 50% моно- и полисинаптических рефлексов, очень близки к концентрациям, которые полностью блокируют рефлексы, что сильно затрудняет подбор терапевтических доз. Ранее было показано, что у крыс при моделировании хронической травмы спинного мозга антиспастическое действие баклофен оказывает в дозах, при которых наблюдается полная утрата всех рефлексов и проявляются побочные эффекты, такие как потеря контроля мочевого пузыря [17].

Дантролен, вводимый за 20 мин до морфина (40 мг/кг), не влиял (см. рис. 3, б) на выраженность реакции Штрауба в диапазоне использованных доз (20, 30, 60 и 100 мг/кг). Между тем эффективность дантролена на данной модели спастичности была показана ранее, при этом расчетная эффективная доза (ЭД50) составляла 37,3 мг/кг при внутрибрюшинном введении [12] и 14,4 мг/кг при пероральном введении [18]. Однако в этих работах использовали морфин в относительно низкой дозе (15 мг/кг), которая не обеспечивает выраженность реакции Штрауба более, чем при нормальном физиологическом состоянии. Выявленная неэффективность также может быть отчасти связана с плохой растворимостью в воде этого высоколипофильного препарата, даже при использовании поверхностно-активного вещества Tween 80 (2%). Именно это свойство дантролена ограничивало его клиническое использование до тех пор, пока не были изготовлены лиофилизированные формы препарата [19]. Кроме этого известно, что применение дантролена не приводит к нормализации мышечного тонуса у больных, перенесших инсульт [20].

Тизанидин (0,2; 0,3; 0,6 и 1 мг/кг) дозозависимо влиял на интенсивность реакции Штрауба, подавляя ее выраженность в максимальных из использованных доз (см. рис. 3, в). Дисперсионный анализ выявил значимый эффект фактора «доза» (F(4,45)=6,1; p=0,001), фактора «интервал» (F(5,235)=129,3; p<0,0005), но не взаимодействия этих двух факторов (F(20,235)=1,5; p=0,096). Таким образом, в настоящем исследовании эффективные дозы тизанидина были меньше, чем в работах N. Coward и T. White [21] и S. Farkas и соавт. [13], при этом в диапазоне исследованных доз тизанидин не оказывал значимого влияния на двигательную активность животных.

см. рис. 4

Ципрогептадин, инверсный агонист 5-HT2-рецепторов [22], дозозависимо подавлял выраженность реакции Штрауба (F(3,36)=7,53; p<0,0005). Дисперсионный анализ выявил также значимый эффект интервала (F(9,324)=114,0; p<0,0005) и взаимодействия факторов «доза» и «интервал» (F(27,324)=2,58; p<0,005). В максимальной из использованных доз (10 мг/кг) ципрогептадин значимо подавлял интенсивность реакции Штрауба, не изменяя двигательную активность животных (данные не представлены). Ранее подобные эффекты не были обнаружены у дозы ципрогептадина [9].

Метисергид, неселективный антагонист 5-HT2-рецепторов [23], не оказывал влияния на выраженность реакции Штрауба ни в одной из использованных доз (1—5,6 мг/кг; F(3,36)=1,39; p=0,26; см. рис. 3, б). Это противоречит существующим данным M. Zarrindast и соавт. [7], которые выявляли подавляющее действие метисергида (1 и 2 мг/кг) на интенсивность реакции Штрауба после введения морфина в дозах 20 и 40 мг/кг. Несмотря на сходство диапазона исследованных доз препаратов в проведенных исследованиях, сопоставить данные сложно из-за методических различий. Возможно, что отсутствие влияния на выраженность реакции Штрауба связано и с тем, что метисергид также является агонистом 5-HT1-рецепторов [23]. Неэффективность метисергида, в отличие от ципрогептадина, отмечали также в экспериментах, где реакция Штрауба была вызвана введением вератрамина [24].

Использованная в данной работе экспериментальная модель относительно проста и позволяет быстро оценить антиспастическое действие фармакологических средств, однако она не отражает полностью возможные механизмы развития данной патологии, а автоматически воспроизводит состояние спастичности. Тем не менее модель обладает хорошей предиктивной валидностью и может быть весьма полезной для первичного скрининга потенциально эффективных веществ. Так, в настоящей работе были выявлены эффекты не только у ряда препаратов, активно используемых для лечения различных проявлений спастичности, но и подавляющее действие инверсных агонистов 5-НТ2-рецепторов, эффективность которых недавно была показана на принципиально иной модели спастичности — модели хронической травмы спинного мозга у крыс (Murray, 2010 г.). Полученные данные будут использованы для определения диапазона эффективных доз и оценки действия данного класса веществ на моделях спастических состояний другого генеза.