Время релаксации анизотропии как метод оценки физико-химической активности цереброспинальной жидкости при остром нарушении мозгового кровообращения

В настоящее время основными показателями состояния биологических жидкостей организма являются результаты лабораторных анализов, учитывающие качественный и количественный состав различных их компонентов. Обычно эти показатели учитываются при проведении интенсивной терапии. Состояние жидких сред зависит не только от этих показателей, но и от активного движения молекул в них. Методы, оценивающие активное движение молекул в биологических жидкостях, в медицинской практике практически не используются. На современном уровне развития представлений об активности молекул можно судить, наблюдая вращение введенных в жидкость молекул красителей, которое зависит от движения собственно молекул, их концентрации в субстрате и резонансного переноса энергии. В последнее десятилетие для исследования данных процессов активно используются методы интеграции флуоресцентной спектроскопии в световой микроскопии с молекулами красителей различной молекулярной массы. Измеряемый параметр — время релаксации анизотропии (ВРА) люминесценции молекул красителя. В медицинской практике оценивается состав таких биологических жидкостей, как плазма, цереброспинальная жидкость (ЦСЖ), моча и др. [1, 2]. Большинство активных субстратов в них относится к веществам со средней молекулярной массой. Именно поэтому для оценки ВРА люминесценции нами был использован родамин 6G.

Цель исследования — изучить время релаксации анизотропии ЦСЖ при острых нарушениях мозгового кровообращения путем анализа кинетики релаксации анизотропии красителя родамин 6G.

Были исследованы образцы ЦСЖ 17пациентов с разными формами патологии ЦНС: субарахноидальное кровоизлияние вследствие разрыва артериальных аневризм — 4 пациента; геморрагический инсульт на фоне гипертонической болезни — 6; ишемический инсульт — 7; дискогенная поясничная радикулопатия — 5; ЦСЖ пациентов, оперированных под спинальной анестезией при травматологических операциях на нижних конечностях (без патологии нервной системы) — 9.

В отличие от традиционного понятия «вязкость жидкости», понимаемого как свойство текучих тел оказывать сопротивление перемещению одной их части относительно другой и определяемого с помощью классических методов, изменение вязкости жидкой среды можно зафиксировать, наблюдая броуновское движение введенных в нее зондовых частиц, которые в растворе вследствие соударения с частицами среды постоянно изменяют скорость и хаотично вращаются. Скорость броуновского вращения частицы в среде в рамках гидродинамического приближения Эйнштейна—Дебая—Стокса определяется коэффициентом диффузии по формуле:

Dd= _______ ,

где Dd — коэффициент вращательной диффузии, T — абсолютная температура, η — вязкость раствора, V — объем частицы, k — постоянная Больцмана.

В эксперименте измеряются поляризованные компоненты интенсивности люминесценции. Параметром, характеризующим поляризацию люминесценции, является анизотропия:

I‖—I┴

r= ________ ,

I‖+2I┴

где I‖ — интенсивность поляризационной компоненты, поляризованной в той же плоскости, что и возбуждающий свет, а I┴ — в ортогональной к ней плоскости.

Родамин 6G (C28H31N2O3Cl, молярная масса — 479,02 г/моль) — краситель с яркой люминесценцией при длине волны 550 нм (максимум — при 568 нм) с квантовым выходом, близким к единице. Поглощение происходит в двух полосах: при 470 и 530 нм. Для проведения исследования в объем растворов, равный 0,1 мл, вводилось 0,5 мкл приготовленного заранее водного раствора родамина. Концентрация красителя в исходном растворе, одинаковая во всех измерениях, была подобрана экспериментально такой, чтобы краситель давал яркую люминесценцию, однако коллективные процессы еще не начинались. Образцы от момента забора и до анализа хранились при температуре 2—5 °C. Помещение для исследований было термостабилизировано при температуре 24 °C. После разведения образец раствора с введенным в него красителем помещался на покровное стекло, после чего в течение 5 мин записывалась одна из поляризационных компонент люминесценции. После замены образца записывалась вторая компонента. Общее время одного исследования составляло около 10 мин — 2 измерения (вертикальная и горизонтальная поляризованные компоненты, измерялись отдельно) со скоростью регистрации около 40 000 фотонов в секунду. Для устранения влияния посторонней засветки помещение, где выполнялось исследование, было затемнено.

Исследование проводилось на лазерном конфокальном люминесцентном микроскопе MicroTime 200 («PicoQuant, GmbH»). Применялся лазер, работающий на длине волны 470 нм, с временны́м разрешением 8 пс, с частотой импульсов 10 МГц. В качестве источника возбуждения использовался лазер LDH-P-C-470B, работающий на частоте 10 МГц, с длиной волны около 470 нм, длительностью импульса от 73 пс, развивающий максимальную мощность до 0,8 мВт. Люминесценция собиралась в диапазоне от 500 нм, размер пинхола (фотографическая камера без линз, где в качестве объектива используется небольшое отверстие; от англ. pinhole— булавочное отверстие) в конфокальной схеме 50 нм.

Люминесценция образца возбуждается лазером, затем через объектив лазерный луч попадает на пинхол, который устанавливается в фокусе цилиндрической линзы и устраняет лучи, идущие не из фокуса объектива, обеспечивая высокое пространственное разрешение. Далее луч проходит через сеть фильтров. Регистрация осуществлялась лавинным^​1​᠎ фотодиодом, работающим в режиме время-коррелированного счета одиночных фотонов. Для каждого фотона измерялось время между вспышкой лазера и событием регистрации с точностью 8 пс.

Первоначально были проведены эксперименты с очищенной водой (в 1 мл воды разводили 5 мкл раствора родамина 6G). Полученное для воды значение ВРА, составившее 305 пс, в дальнейшем было использовано как опорная точка при рассмотрении остальных значений. На рис. 1 показаны кривые изменения поляризационных компонент люминесценции молекул родамина 6G в очищенной воде. Время на графике указано с момента вспышки лазера. Разная форма кривых на графиках обусловлена тем, что параллельная компонента возбуждается непосредственно, в то время как перпендикулярная компонента  — за счет поворота возбужденных молекул из исходного положения.

На рис. 2 приведена кривая изменения анизотропии люминесценции. Время на графике отсчитывалось с момента начала спадания верхней кривой.

У больных без патологии ЦНС (группа сравнения) ВРА родамина 6G имело незначительный «коридор» — 311 (304—312) пс (рис. 3). В анализах ЦСЖ больных с дискогенной поясничной радикулопатией ВРА составило 329 (324—332) пс. При ишемических инсультах данный показатель превышал контрольные значения, составив 344 (341—354)  пс. Наиболее высокие значения ВРА ЦСЖ были выявлены у больных с субарахноидальным кровоизлиянием и геморрагическим инсультом. При субарахноидальном кровоизлиянии ВРА составило 357 (334—368) пс, при геморрагическом инсульте ВРА намного превышало нормальные показатели и составляло 422 (412—439) пс.

Наряду с изучением изменений ВРА ЦСЖ в зависимости от типа повреждения ЦНС интерес представляла динамика данного показателя в ходе проводимой терапии. Возможность ее отследить имелась у больных с субарахноидальным кровоизлиянием и у пациентов c геморрагическим инсультом, которым в ходе оперативного вмешательства были установлены внутрижелудочковые катетеры для контроля внутричерепного давления, из которых в последующем проводили отбор проб ЦСЖ в 1—2, 4—5, 6—7 и 8—9-е сутки заболевания (рис. 4). Максимальное значение ВРА родамина 6G — 424 (421—432) пс было зафиксировано в группе больных с геморрагическим инсультом в дебюте заболевания. Далее наблюдалось постепенное снижение ВРА. На 4—5-е сутки наблюдения отмечено незначительное снижение данного показателя до 421 (417—423) пс. Однако к 8—9-м суткам заболевания ВРА родамина 6G у обследованных больных составляло уже 340 (336—349) пс, что, по-видимому, обусловлено начинающимися процессами санации ЦСЖ за счет лизиса эритроцитов и продуктов их распада, а также снижением концентрации высокомолекулярных соединений, в том числе белковых молекул.

Результатом данной работы является обнаруженная связь между характером заболевания и ВРА ЦСЖ человека. Значения ВРА ЦСЖ пациентов без патологии нервной системы достаточно близки, в то время как при поражении нервной системы значения ВРА могут существенно увеличиваться, а отклонение от нормы соответствует тяжести заболевания. Кроме диагностики заболеваний метод также может найти свое применение при контроле состояния пациента в клинических условиях. Можно считать, что использование метода конфокальной лазерной спектрометрии заслуживает дальнейшего изучения и после дополнительных исследований может рассматриваться как метод оценки состояния ЦНС.