Крюков А.И.

ГБЗУ «Московский научно-практический центр оториноларингологии им. Л.И. Свержевского», Москва

Валихов М.П.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России, Москва, Россия, 119034

Царапкин Г.Ю.

ГБУЗ «Научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л.И. Свержевского», Москва, Россия

Товмасян А.С.

Московский научно-практический центр оториноларингологии Департамента здравоохранения Москвы

Арзамазов С.Г.

Отделение болезней уха, горла и носа ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова

Кондратьев Н.В.

ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», Москва, Россия

Костюк Г.П.

Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского Минздрава России, Москва, Россия, ФГБОУ ВПО Институт медико-социальных технологий, Москва, Россия, Психиатрическая клиническая больница №1 им. Н.А. Алексеева, Москва, Россия

Голимбет В.Е.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Получение нейросфер и нейрональных прогениторных клеток из обонятельного эпителия

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2019;84(1): 31-35

Просмотров : 20

Загрузок :

Как цитировать

Крюков А. И., Валихов М. П., Царапкин Г. Ю., Товмасян А. С., Арзамазов С. Г., Кондратьев Н. В., Костюк Г. П., Голимбет В. Е. Получение нейросфер и нейрональных прогениторных клеток из обонятельного эпителия. Вестник оториноларингологии. 2019;84(1):31-35. https://doi.org/10.17116/otorino20198401131

Авторы:

Крюков А.И.

ГБЗУ «Московский научно-практический центр оториноларингологии им. Л.И. Свержевского», Москва

Все авторы (8)

Актуальность

Использование стволовых клеток в терапевтических целях является перспективным направлением для различных областей медицины, в том числе связанных с лечением нарушений функций центральной и периферической нервных систем. В его основе лежит выбор подходящего источника аутологических и прогениторных клеток. По мнению многих исследователей, таким источником может быть обонятельный эпителий (ОЭ) полости носа [1—3], содержащий в своем составе прогениторные клетки, которые в процессе культивирования in vivo сохраняют способность к непрерывному образованию нейросфер, которые, в свою очередь, являются основным материалом для клеточной терапии. ОЭ представляет собой нейрональную ткань, клетки которой способны к регенерации. В этой ткани происходит постоянное обновление мультипотентных клеток с их дифференциацией в зрелые нейроны. Анатомическое расположение ОЭ в полости носа определяет его доступность. На сегодняшний день это единственный источник аутологических нейральных стволовых прогениторных клеток, которые могут быть использованы для изучения патогенеза обонятельных расстройств [4], психических и неврологических заболеваний [3], а также обкладочных глиальных клеток, трансплантация которых открывает новые перспективы в лечении травматических повреждений спинного мозга и периферических нервов. Аутологичные нейральные стволовые клетки и прогениторные клетки являются мультипотентными предшественниками и способны дифференцироваться во все типы клеток ОЭ, в том числе в зрелые нейроны, а также в глиальные клетки. Обкладочные клетки (ensheathing cells) выполняют разнообразные функции: создают микроокружение для нейронов, способствуют росту аксонов и ремиелинизации нервных волокон. В последнее время большие надежды возлагаются на использование клеточных моделей, созданных на основе стволовых клеток, для проведения фундаментальных исследований (поиск молекулярных маркеров заболевания, изучение функций генов, выявление генетических дефектов и их репарация с помощью инновационной технологии геномного редактирования). Успешность создания таких моделей прямым образом зависит от получения достаточного количества материала, отбираемого у одного пациента, и возможности включения в исследование большого числа образцов. Стволовые технологии подразумевают междисциплинарный подход в решении поставленных задач и во многом зависят от качества выполнения каждого этапа исследования. Оториноларинголог является первым звеном в цепи сложных научных изысканий по получению стволовых клеток из ОЭ полости носа. Передняя риноскопия, эндоскопическое исследование полости носа и ольфактометрическое тестирование позволяют провести отбор пациентов по ранее определенным параметрам. Оториноларинголог, выполняя свой этап работы, проводит хирургические манипуляции в обонятельной области полости носа, которая распространяется от нижнего края средней носовой раковины до свода полости носа. Эпителиальный покров слизистой оболочки в этой области состоит из обонятельных биполярных клеток, представленных веретенообразными, базальными и поддерживающими клетками [5]. Распределение О.Э. в обонятельной области полости носа не однородно и может варьировать от 10 до 90% [6]. Исследования, проведенные на аутопсийном материале, показали, что ОЭ был обнаружен в 83% образцов, взятых из верхней носовой раковины, и только в 17% — из средней носовой раковины [7]. Но следует отметить, что эти данные не отражают концентрацию ОЭ в слизистой оболочке изученных локусов полости носа.

Несмотря на то что назальная биопсия является стандартной процедурой для оториноларинголога, получение культур клеток из биоптата зависит от многих условий и факторов. Выбор места забора биоптата должен соответствовать критериям безопасности для больного и соответствовать максимально возможной концентрации клеточного материала, необходимого для выполнения последующих этапов работы. Рутинный характер работы подразумевает проведение данной хирургической манипуляции под местной анестезией. В этой связи забор биоптата слизистой оболочки верхней носовой раковины накладывает ряд объективных ограничений.

Цель исследования — определение наиболее оптимального локуса в полости носа для забора биологического материала, служащего источником прогениторных нейрональных клеток.

Исследование проведено в рамках проекта, связанного с изучением молекулярно-генетических аспектов особенностей мышления больных шизофренией и психически здоровых людей.

Материал и методы

Под нашим наблюдением находились 45 человек (21 женщина и 24 мужчины в возрасте от 22 до 45 лет), которые были разделены на две клинические группы. В 1-ю группу были включены 30 пациентов с искривлением перегородки носа и вазомоторным ринитом, поступившие на хирургическое лечение в ГБУЗ НИКИО им. Л.И. Свержевского (Москва). 2-ю группу (15 человек) составили больные шизофренией, которые находились на стационарном лечении в ГКУЗ ПКБ № 1 им. Н.А. Алексеева (Москва) и были включены в исследование после клинического состояния. Критерии включения: пациенты без нарушения обонятельной функции носа, возраст от 18 до 45 лет, образование не менее 9 классов, европейское происхождение (желательно этнически русские), отсутствие тяжелых соматических заболеваний. Критерии исключения: наличие сопутствующих тяжелых неврологических и соматических заболеваний, сотрясение головного мозга в анамнезе, аллергический ринит, острый и хронический синусит.

Протокол исследования и образец информированного согласия были одобрены Этическим комитетом ФГБНУ НЦПЗ.

Следуя установленным критериям включения, всем пациентам проводилось ольфактометрическое исследование в соответствии с обонятельной шкалой Bernstein (рис. 1).

Рис. 1. Набор пахучих веществ, воздействующих на обонятельный рецептор.

Нашу работу мы условно разделили на два этапа. На первом этапе у пациентов 1-й группы изучали концентрацию нейрональных прогениторов в слизистой оболочке в трех локусах полости носа, легко доступных в рутинной практике оториноларинголога. Локус, А — слизистая оболочка перегородки носа на уровне прикрепления переднего конца нижней носовой раковины, локус В — передний отдел медиальной поверхности средней носовой раковины в месте ее крепления к латеральной стенке полости носа и локус С — верхний отдел перегородки носа, находящийся напротив локуса В (рис. 2).

Рис. 2. Точки забора слизистой оболочки полости носа в изучении концентрации нейрональных прогениторных клеток. Локус, А — *, локус В — ** и локус С — ***.

У пациентов 1-й группы забор биологического материала проводили по завершении септопластики носовыми биопсийными щипцами под визуальным контролем ригидными эндоскопами Carl Storz, HOPKINS II 0°, 4 мм (Германия). Размер биоптата в каждом исследовании был идентичен и не превышал 2 мм в диаметре. Далее перегородку носа шинировали оригинальными септальными стентами, которые фиксировали по методике А.И. Крюкова и соавт. [8]. На завершающем этапе распатором подслизисто разрушали кавернозную ткань нижних носовых раковин. Полость носа тампонировали силиконовыми секционными гидротампонами, которые удаляли через 24 ч после операции [9].

Отобранный материал помещали в пробирку, содержащую 1 мл среды DMEM/HAM F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (10%) и антибиотика (1%). Образцы доставляли в лабораторию в течение 3 ч после отбора биопсии. Информация о локусе забора биопсии не раскрывалась до завершения экспериментов (слепой метод). Образец эпителия промывали в среде DMEM/HAM F12, далее помещали в чашку Петри с раствором реагента для диссоциации клеток (диспаза) и инкубировали 1 ч при 37 °C. Здесь и далее во все среды добавляли 1% раствор антибиотика. Под микроскопом отделяли эпителий от собственной пластинки (lamina propria) и разделяли на 3—4 фрагмента толщиной не более 0,5 мм. Каждый фрагмент помещали в отдельную лунку 6-луночного планшета, покрывали сверху покровным стеклом, в каждую лунку добавляли 1,5 мл среды DMEM/HAM F12 с 10% FBS. Планшет помещали в СО2-инкубатор (5% СО2, 37 °С) на 14—18 дней, смену среды проводили каждые 3—4 дня для получения не менее 10 000 клеток. Каждую клеточную популяцию, полученную из биоптата полости носа, разделяли поровну на 2 образца. Первый использовали в качестве контроля для выявления автофлуоресценции, а второй окрашивали двумя типами антител: антитела к нейрональной молекуле клеточной адгезии (NCAM) для распознавания нейронов и их предшественников и А2B5 для распознавания предшественников олигодендроцитов («BioLegend», США) по протоколу, предложенному производителем. Затем проводили анализ образцов на проточном цитометре MoFlo XDP («Beckman Coulter Inc.», США). Нейросферы, полученные из образцов ОЭ, окрашивали антителами на βIII-tubulin, MAP2 («BioLegend», США), которые являются цитоплазматическими маркерами нейронов, и флуоресцентным красителем DAPI («Invitrogen», США) для выявления ядер. Микроскопическое исследование окрашенных нейросфер проводили на конфокальном микроскопе A1R Nikon Ti («Nikon», Япония) с увеличением ×20.

После выявления локуса полости носа с наибольшей концентрацией ОЭ приступали ко второму этапу нашей работы. Забор биопсийного материала слизистой оболочки полости носа проводили под местной анестезией (аппликация 10% раствора лидокаина) из одного локуса у больных 2-й группы. Для получения культуры нейросфер первичную культуру клеток, полученную эксплантным методом из биоптатов обонятельной выстилки, пересевали при помощи раствора трипсина-ЭДТА (ООО «Панэко», Россия) на культуральные флаконы, предварительно покрытые раствором поли-L-лизина («Sigma», США). Культивирование осуществляли при помощи среды DMEM/HAM F12 c добавлением 1% раствора ITS (Gibco), 1% раствора антибиотика-антимикотика, ростовых факторов (bFGF, EGF) в концентрации 50 нг/мл.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных измерений на проточном цитометре не было обнаружено клеток, окрашенных A2B5. Это свидетельствует о том, что в культуре отсутствовали глиальные клетки. Для маркера NCAM был получен положительный сигнал (NCAM+) во всех анализируемых образцах. Среднее процентное содержание NCAM+ клеток для биоптатов из локуса, А составило 7,8%; из локуса В — 42,7%; из локуса С — 18,2%. Обнаружены значимые различия доли NCAM+ клеток в зависимости от участка носовой полости, откуда была взята биопсия, при этом статистически значимые отличия наблюдались между областями A и В (p=0,00012) и В и С (p=0,011) (рис. 3).

Рис. 3. Доля клеток, окрашенных NCAM, в биоптатах обонятельной выстилки из разных областей носовой полости.

Для того чтобы показать, что данные культуры являются источником клеток-предшественников, из них были получены нейросферы, фотографии которых представлены на рис. 4 ().

Рис. 4. Нейросфера, полученная из первичной культуры обонятельного эпителия. а — совмещенное изображение; б — окрашивание ядерным красителем DAPI; в — окрашивание на βIII-tubulin; г — окрашивание на MAP2.
Полученные нейросферы были окрашены при помощи цитоплазматических маркеров βIII-tubulin и MAP2, которые являются маркерами нейронов. Во всех случаях отобранный материал был пригоден для дальнейшего анализа (см. рис. 4).

Таким образом, нейрональные клетки присутствовали во всех исследуемых участках, которые могут быть доступны при проведении биопсии в условиях местной анестезии. Однако количество этих клеток значительно различалось. Следует отметить, что поиску участков полости носа, из которых можно проводить отбор ОЭ для получения прогениторных клеток, было посвящено несколько работ, результаты которых не являются однозначными. Так, в раннем исследовании [10] сообщалось об отборе клеток с верхних отделов перегородки носа и примыкающей к ней поверхности средней носовой раковины, однако не упоминалась степень эффективности отбора. В работе [6] исследовали участки в верхней носовой раковине, средней носовой раковине и перегородке носа. Вероятность обнаружения ОЭ в этих участках варьировала от 30 до 76%, наибольшее число клеток удалось выявить в участках, расположенных в верхней носовой раковине и перегородке носа. W. Winstead и соавт. [11] получали образцы ОЭ из перегородки носа, верхней носовой раковины и средней носовой раковины. В целом прогениторные клетки были выявлены только у половины пациентов, включенных в исследование, и находились они в основном в верхней носовой раковине. B. Wrobel и соавт. [12] показали, что средняя носовая раковина является легко достигаемым и безопасным в условиях местной анестезии источником прогениторных клеток. В недавней работе, проведенной на выборке, состоящей из 5 пациентов, у которых биопсию проводили при местной анестезии, обнаружено, что в большинстве наблюдений источником нейросфер была область перегородки носа, и только у одного человека они были обнаружены в материале, взятом из верхней носовой раковины [13].

В нашем исследовании показано, что средняя носовая раковина является более эффективной в отношении содержания прогениторных клеток, чем верхняя треть перегородки носа. Этот участок также является доступным и безопасным при отборе ОЭ при местной анестезии, что подтверждается проведением биопсии в условиях отоларингологического кабинета у 15 пациентов.

Выводы

1. При цитометрическом исследовании эксплантных культур на 10 000 клеток, выращенных из биоптатов, взятых с медиальной поверхности средней носовой раковины в месте ее крепления к латеральной стенке полости носа, процентное содержание NCAM+ клеток составило 42,7%, с верхних отделов перегородки носа напротив места прикрепления переднего конца средней носовой раковины — 18,2%, с перегородки носа на уровне прикрепления нижней носовой раковины — 7,8%.

2. Отбор обонятельного эпителия из области средней носовой раковины в условиях местной анестезии у больных шизофренией в 100% случаев позволил получить нейросферы, содержащие клетки, окрашиваемые нейрональными маркерами.

Полученные нами результаты могут быть использованы как в дальнейших фундаментальных исследованиях, так и в практической оториноларингологии.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056) в части, связанной с выбором места забора назальной биопсии, проведением отбора образцов, культивированием клеточных культур, и гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 17−29−02164) в части, связанной с подбором больных шизофренией для проведения биопсии и цитометрического исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: arzamazovs@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-9540-0696

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail