Лаберко Е.Л.

Кафедра оториноларингологии педиатрического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России Москва, Россия, 117997

Талалаев А.Г.

кафедра патологической анатомии педиатрического факультета РНИМУ Минздрава России, Москва, Россия, 117997

Богомильский М.Р.

Кафедра отоларингологии педиатрического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова

Буллих А.В.

Морозовская ДГКБ Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия, 119049

Методика объективного изучения состояния мукоцилиарного клиренса у детей

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2015;80(2): 40-44

Просмотров : 37

Загрузок :

Как цитировать

Лаберко Е. Л., Талалаев А. Г., Богомильский М. Р., Буллих А. В. Методика объективного изучения состояния мукоцилиарного клиренса у детей. Вестник оториноларингологии. 2015;80(2):40-44. https://doi.org/10.17116/otorino201580240-44

Авторы:

Лаберко Е.Л.

Кафедра оториноларингологии педиатрического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России Москва, Россия, 117997

Все авторы (4)

«Золотым стандартом» в изучении мукоцилиарного клиренса (МЦК) по праву считается сахариновый тест как наиболее простой в применении, неинвазивный, общедоступный и достаточно достоверный метод. Данный метод позволяет получить интегральную оценку состояния мукоцилиарного транспорта, так как результат исследования зависит от состояния обоих звеньев клиренса (реологических свойствах слизи и двигательной активности мерцательного эпителия). Однако, несмотря на все плюсы, этот метод исследования транспортной функции слизистой оболочки полости носа является субъективным, т. е. позволяет косвенно оценивать состояние мукоцилиарного клиренса, ориентируясь исключительно на ощущения пациента. В связи с этим существуют ограничения при использовании сахаринового теста: ранний детский возраст, извращенная вкусовая чувствительность, психиатрическая патология. Кроме того, данный метод дает только общую оценку состояния мукоцилиарного клиренса, не предоставляя никакой конкретной информации о состоянии каждого из его звеньев. Предлагаемая методика является объективной, поскольку предоставляет наглядную и объективную информацию для оценки транспортной функции слизистой оболочки (СО) полости носа, а именно ее цилиарного аппарата (ЦА). ЦА представлен апикальным концом эпителиоцита с расположенными на нем ресничками, совершающими колебательные движения, направленные в сторону носоглотки на всех участках (кроме передних отделов полости носа приблизительно на протяжении одного сантиметра, где движение ресничек направлено в сторону преддверия носа) [1—3].

По данным литературы, именно недостаточность двигательной активности ЦА является одним из ключевых моментов в развитии воспалительных заболеваний полости носа. Механизмы формирования морфофункциональных изменений цилиарного аппарата до сих пор остаются малоизученными, а имеющиеся данные весьма противоречивы, в связи с чем изучению работы ресничек мерцательного эпителия уделяется большое внимание [1, 2].

Основным критерием оценки работы ЦА является частота биения ресничек (ЧБР). Это количество циклов, совершаемых ресничками в секунду времени, измеряется в герцах (Гц). Большинство отечественных и зарубежных исследователей определяют именно этот параметр работы, считая его самым объективным и наглядным отражением функции работы мерцательного эпителия.

По данным литературы, скорость МЦК напрямую зависит от частоты биения ресничек. При этом снижение показателя ЧБР на 15% приводит к снижению мукоцилиарного транспорта на 56% [4].

Впервые цилиарная активность была открыта в 1835 г. Sharpey и лишь спустя век цилиарную активность стали рассматривать как ведущее звено в физиологии околоносовых пазух [5, 6]. W. Messerklinger [7] впервые изучил направление перемещения слизи в полости носа и околоносовых пазухах, а также пути дренирования для каждой из околоносовых пазух, и основал теорию патогенеза синусита. Также он предположил, что какие-то области полости носа и околоносовых пазух имеют лучший дренаж за счет более быстрого МЦК.

Фото- и видеофиксацию работы клеток мерцательного эпителия впервые осуществил A. Proetz в 1953 г., но в то время применение метода представляло собой большие технические сложности, поэтому он не получил широкого практического применения [8]. Термин «частота биения ресничек» применили Т. Dalhamm и соавт. [9, 10], исследовавшие СО трахеи, когда появилась возможность объективной оценки ЦА методом фиксации преломления света, проведенного через участок СО. В то время подсчеты проводились вручную, были трудоемки и занимали много времени. По мере развития технических возможностей и появления компьютерной техники стал реальным автоматизированный анализ работы ЦА.

Несмотря на накопление значительного количества информации, в настоящее время остается много нерешенных вопросов, касающихся исследования ЦА.

Ряд авторов предлагают проводить исследование не отдельных клеток, а клеточных пластов, видя в этом ряд преимуществ. K. Ingels и соавт. [11] провели сравнение двух различных методик по забору материала для прижизненного микроскопического исследования работы мерцательного эпителия — малоинвазивного забора с помощью кюретки и инвазивного с применением щипцов. Клетки эпителия, взятого с помощью щипцов, не теряют связи с базальной мембраной, поэтому сохраняют свою активность в течение длительного времени. Материал должен быть помещен в среду с физиологическими параметрами осмолярности, рН и температурой. Одни исследователи для забора клеточного материала применяют специально созданные ложечки собственной конструкции [12, 13], другие используют метод щеточной биопсии [14].

По некоторым данным, цилиарные клетки в целом пласте (рис. 1) демонстрируют значительно лучшие показатели ЧБР и синхронность работы, чем клетки в поврежденном пласте или отдельные клетки (рис. 2). Это говорит о наличии межклеточных взаимодействий (клеточной кооперации) и подтверждает необходимость выбирать целые клеточные пласты для фиксации объективных показателей работы ЦА [15].

Рис. 1. Микропрепарат клеток мерцательного эпителия (световой микроскоп, ув. 1000). Представлены эпителиоциты в клеточном пласте.

Рис. 2. Микропрепарат клеток мерцательного эпителия (световой микроскоп, ув. 1000). Представлены отдельные эпителиоциты.

Существуют два метода изучения мерцательного эпителия: исследование взятого методом биопсии клеточного материала вне питательных сред и в питательной среде. Цитологический материал в целом способен сохранять жизнедеятельность в физиологическом растворе до 30—40 мин, отдельные клетки сохраняют жизненную активность в пределах 3—4 ч. При необходимости изучения длительного воздействия лекарственных препаратов на СО носа применяют питательные среды, позволяющие культивировать мерцательный эпителий в течение нескольких дней и недель [16, 17].

Следующим спорным вопросом является выбор участка СО носа для исследования. По одним данным, различия в ЧБР клеток СО разных отделов полости носа (нижняя раковина, крючковидный отросток, сфеноэтмоидальный карман) отсутствуют [18]. Это противоречит мнению о существовании различий в ЧБР клеток из разных участков слизистой оболочки полости носа [19]. По данным разных авторов, ЧБР мерцательного эпителия полости носа находится в пределах 5,1—12,6 Гц [19—21].

Еще одним критерием оценки деятельности мерцательного эпителия является определение синхронности биения ресничек в цельном клеточном пласте. В методике, предложенной Е.А. Ружицкой [14], предлагается оценить синхронность движения (синхронное, асинхронное), характер движения (ундулирующее, пульсирующее, хаотичное), интенсивность движения ресничек в баллах, степень десквамации эпителия в баллах, соотношение клеток с подвижными и неподвижными ресничками и их жизнеспособность в течение 2—3 ч. Данная методика позволяет «на глаз», без применения компьютерных технологий, уже при рассматривании материала через микроскоп оценить морфофункциональное состояние слизистой оболочки.

Цель работы — создание доступной, легкой в использовании и применимой при обследовании детей методики изучения состояния МЦК.

В исследование были включены 70 детей в возрасте от 6 до 17 лет, находившихся на лечении в ГБУЗ Морозовская ДГКБ Департамента здравоохранения Москвы. 50 детей проходили лечение в ЛОР-отделении с диагнозом: острый риносинусит (основная группа), 20 больных являлись пациентами хирургического отделения, не имели патологии ЛОР-органов и составили контрольную группу. Всем больным были проведены сахариновый тест и изучение двигательной активности мерцательного эпителия в первые и последние сутки госпитализации. Критерии исключения из исследования: возраст менее 6 лет, наличие атопической патологии, сердечно-сосудистые и неврологические заболевания, искривление перегородки носа и хронический синусит, а также длительное применение назальных деконгестантов в анамнезе. Для контрольной группы критерием исключения было также наличие инфекционно-воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей в последние 2 мес.

Пациенты и методы

Первым этапом исследования проводили сахариновый тест (СТ). Для проведения теста таблетка сахарозаменителя делилась на 4 равные части диаметром около 1 мм и ее четвертинка пинцетом помещалась на слизистую нижней носовой раковины, отступя 1 см от ее переднего конца. Далее засекалось время от момента установки таблетки до появления у пациента ощущения сладкого вкуса. Это время считается временем сахариновой пробы или временем СТ [22].

Второй этап — микроскопическое исследование. Вначале осуществлялся забор клеточного материала. С этой целью применяли малоинвазивный метод щеточной биопсии с использованием специальной урогенитальной щеточки, широко применяющейся в гинекологии. Забор производили следующим образом: ворсинчатую часть щеточки помещали между нижней носовой раковиной и перегородкой носа ребенка на расстоянии не более 2 см от носового клапана и несколькими движениями в сторону носоглотки и обратно с небольшой амплитудой производили взятие материала с медиальной поверхности нижней носовой раковины, дна полости носа и носовой перегородки одновременно [14]. В детской практике данный способ забора применяется впервые (методика одобрена Этическим Комитетом РГМУ на заседании № 105 от 14.02.2011).

Клеточный материал помещали в изотонический раствор 0,9% хлорида натрия комнатной температуры в небольшом объеме для получения более концентрированного материала. В дальнейшем с помощью микропипетки клеточный материал переносили на предметное стекло и накрывали покровным. Далее в световой микроскоп при малом увеличении (×100) производили поиск участков с наибольшей концентрацией клеточного материала. Затем интересующий участок рассматривали под более сильным увеличением (×600 или ×1000) с использованием иммерсионного масла. С целью определения ЧБР проводили запись интересующего фрагмента СО на жесткий диск компьютера [Intel Core2 (2,4 GHz 992 Мб ОЗУ)], имеющего операционную систему Windows, с помощью видеокамеры Hitachi HV-F22, подсоединенной к персональному компьютеру. Использовалось программное обеспечение Мекос-Ц, приложение «фототека» фирмы ЗАО «Мекос», созданное для работы с препаратами крови. Основным преимуществом методики является техническая простота, так как видеокамера подсоединяется непосредственно к персональному компьютеру, функцию видеозахвата осуществляет видеокарта компьютера. Необходимость в дополнительном оборудовании отсутствует (рис. 3).

Рис. 3. Оборудование для проведения микроскопического исследования. 1 — видеокамера; 2 — микроскоп; 3 — системный блок персонального компьютера; 4 — монитор; 5 — блок питания микроскопа.

Компьютерное параметрирование записанного видеоматериала выполнялось посредством стандартного программного обеспечения Windows-media player в режиме покадрового воспроизведения, позволяющего выполнять раскадровку видеофрагмента для подсчета ЧБР в ручном режиме. С этой целью у одного пациента проводили подсчет ЧБР не менее 20 отдельных клеток и определяли средний показатель (Гц). Максимально возможная ЧБР, которую можно определить, зависит от такого параметра видеокамеры и программного обеспечения, как кадровая частота [frames per second (FPS)]. Для объективного подсчета ЧБР желательно применять высокочастотные видеокамеры с FPS до 250 кадр/с. Стандартные видеокамеры имеют FPS 24—25 кадр/с, это в свою очередь ограничивает измерение ЧБР 12—12,5 Гц, поскольку для определения одного удара реснички необходимо визуализировать ресничку в фазе замаха, в движении и вновь вернувшуюся в фазу замаха, что занимает 2 кадра. Средняя ЧБР находится в пределах 5,1—12,6 Гц, такой кадровой частоты вполне достаточно для проведения измерений [19—21]. По нашим наблюдениям, некоторые реснички не совершали полный колебательный цикл за определенное число кадров (отмечалось отклонение в один кадр). В этом случае для подсчета ЧБР было взято среднее количество кадров, за которое можно записать полный колебательный цикл. В результате появились значения с половинами кадров. Определение ЧБР проводилось по формуле ЧБР = кадровая частота (кадр/с)/количество кадров в колебательном цикле (кадр) (1/с=Гц).

Например: при кадровой частоте 25 кадр/с одна фаза биения реснички составляла 3—4 кадра (в среднем 3,5 кадра). В этом случае для определения ЧБР кадровую частоту видеокамеры делили на количество кадров: 25 кадров/с:3,5 кадра=7,14 1/с (Гц).

Статистическая обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере с использованием программ Statistica 6.1 («StatSoft Inc.», США), Microsoft Excel 2007 путем подсчета средней арифметической величины (М), стандартного отклонения (SD), критерия Стьюдента (t), критерия Манна—Уитни (U). Различия считались достоверными при значениях p<0,05.

Результаты и обсуждение

У пациентов контрольной группы ЧБР мерцательного эпителия полости носа составила 6,0±0,7 Гц. У пациентов с острым синуситом в начале лечения ЧБР составляет 5,2±0,81 Гц (диапазон: 3,8—6,1 Гц), что достоверно меньше показателей контрольной группы (p<0,05). При наступлении реконвалесценции ЧБР возрастает до 6,1±0,80 Гц (диапазон: 4,3—6,2 Гц), что соответствует показателям контрольной группы (р>0,05). Этот факт свидетельствует о нормализации двигательной активности ресничек мерцательного эпителия сразу по окончании действия патологических факторов, что позволяет рассматривать его как критерий выздоровления (рис. 4).

Рис. 4. Частота биения ресничек у пациентов с острым риносинуситом и у детей контрольной группы. Здесь и на рис. 5: I — основная группа (исходные данные); II — основная группа (после лечения); III — контрольная группа.

Время СТ у детей контрольной группы равнялось 8,8±4,99 мин, а в группе с острым риносинуситом в начале лечения — 9,3±10,4 мин (в интервале от 7,5 до 40 мин), при выписке — 13,4±4,96 мин (в интервале 6—23 мин). Оба показателя достоверно ниже (p<0,05) времени мукоцилиарного транспорта здоровых детей. Данный факт свидетельствует о том, что полного восстановления транспортной функции мерцательного эпителия сразу при наступлении клинического выздоровления не происходит. Это, скорее всего, связано с более длительной нормализацией оптимальных реологических свойств и объема слизи (рис. 5).

Рис. 5. Время сахаринового теста у пациентов с острым риносинуситом и детей контрольной группы.

Таким образом, с помощью предлагаемой методики, технически более простой, чем существующие, получены результаты, соответствующие данным литературы [13, 19]. Показано наличие корреляции между ЧБР и транспортной функцией СО полости носа: при увеличении ЧБР на 14,7% происходит увеличение скорости МЦК на 56%, что также соответствует данным литературы [4].

Выводы

1. В функционировании мукоцилиарного транспорта нельзя рассматривать в качестве ведущего звена только биение ресничек эпителиоцитов или параметры слизи: в равной степени определяющее значение имеют оба этих компонента.

2. Для получения наиболее полной информации о состоянии мукоцилиарного клиренса необходимо совмещать методы сахаринового теста и исследования ЧБР.

3. Показатель ЧБР может быть использован как дополнительный критерий реконвалесценции у пациентов с острой воспалительной патологией полости носа и околоносовых пазух.

4. Полного восстановления транспортной функции мерцательного эпителия не происходит сразу при наступлении клинического выздоровления.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail