Введение

Барьерная функция глазной поверхности

Глазная поверхность (ГП) представляет собой сложную анатомо-функциональную систему, одной из главных задач которой является обеспечение барьерной функции. Эта система включает липидный, водный и муциновый слои слезной пленки, а также многослойный эпителий роговицы с плотными межклеточными контактами.

Муцины, находящиеся в непосредственном контакте с эпителием, играют ключевую барьерную роль, ограничивая диффузию лекарственных веществ через слизистую оболочку глаза. Муциновый слой представляет собой густую полимерную сеть, состоящую из высокомолекулярных гликопротеинов, обладающих значительным количеством отрицательно заряженных карбоксильных и сульфатных групп. Захват инородных частиц, как и молекулярная проницаемость, определяется не только адгезивными свойствами муцинов, но и вязкостью. Электростатические взаимодействия между отрицательно заряженными участками муцинов и положительно заряженными лекарственными веществами существенно ограничивают проницаемость последних через слизистую оболочку. Дисульфидные связи, образующиеся между цистеиновыми остатками, дополнительно стабилизируют структуру геля [1, 2].

Барьерная функция на уровне роговичного эпителия, в свою очередь, осуществляется за счет межэпителиальных плотных контактов, где аккумулируется множество Ca²⁺-зависимых сайтов связывания (кадгерины в десмосомах, ионные каналы), что также способствует накоплению катионных веществ в этих зонах и препятствует их дальнейшему проникновению.

Особенно тяжело преодолевают описанные барьеры такие катионные офтальмологические препараты, как пилокарпин, тимолол, гентамицин, офлоксацин, тобрамицин и др. [3—6], а также некоторые нейтральные молекулы (дексаметазон [7]), которые за счет ионных и гидрофобных взаимодействий прочно связываются с муцином и анионными сайтами на поверхности эпителия, что ограничивает их проникновение в строму и переднюю камеру глаза.

Ограничения существующих систем доставки офтальмологических препаратов

Традиционные мукоадгезивные носители (pH-чувствительные гели, термочувствительные гели и др.) направлены на продление времени удержания лекарственной формы на поверхности глаза и тем самым лишь косвенно способствуют проникновению действующих веществ, однако не обеспечивают активного преодоления трансмукозального и трансэпителиального барьеров. При этом накопление высококонцентрированных компонентов на глазной поверхности может вызывать деструктивные изменения тканей роговицы и конъюнктивы. К тому же длительная задержка молекул в матрице носителя на глазной поверхности способствует системной абсорбции лекарств через носо-слезный канал. При длительном применении лекарств это может вызвать побочные эффекты.

В последние годы активно ведутся разработки различных усилителей проницаемости для обхода муциново-эпителиального барьера [8]. Катионные полимеры, прежде всего хитозан и его производные, эффективно адгезируются к отрицательно заряженным муцинам, увеличивая текучесть муцинового слоя и его проницаемость, однако высокая молекулярная масса таких полимеров препятствует глубокому проникновению к эпителиальному слою [9]. Поверхностно-активные вещества способствуют преодолению фосфолипидного бислоя эпителиальных клеток, но, как правило, оказывают раздражающий и токсичный эффект. Клеточно-проникающие пептиды (CPPs:) проникают через мембраны за счет электростатических взаимодействий, облегчая доставку макромолекул, но они быстро разрушаются протеазами глазной поверхности, а также имеют высокий потенциал иммуногенности [8]. Хелаторы кальция (EDTA, EGTA, краун-эфиры) связывают Ca²⁺ плотных контактов эпителия, нарушая целостность межклеточных связей и улучшая проникновение лекарств, но также высокотоксичны, вызывают морфологические, иногда необратимые, изменения эпителия роговицы, могут проникать в глубокие слои, повреждая эндотелий и ткани переднего сегмента глаза [10]. В целом можно заключить, что многие из разработанных усилителей проницаемости либо демонстрируют низкую стабильность и ограниченную способность к глубокому проникновению, либо обладают значительной токсичностью и оказывают раздражающее действие.

Концепция управляемого снижения pH глазной поверхности

Возможен еще один путь воздействия на проницаемость барьеров глазной поверхности — модуляция pH в муциновом слое. Исследования подтверждают, что снижение pH существенно влияет на конформацию муцинов [2, 11—13] и ведет к протонированию анионных карбоксильных и сульфатных групп, что в свою очередь ослабляет потенциальную адгезию на муцинах катионных препаратов. Дополнительно избыток протонов может способствовать разрыву дисульфидных связей с образованием протонированных сульфгидрильных групп, что способствует дополнительному «разрыхлению» муцинового слоя. При кислых значениях pH происходит разрушение «мостиков» между муциновыми волокнами и их агрегация [14]. Следовательно, управляемое снижение pH в области слизистого слоя может использоваться как механизм временного ослабления муцинового барьера для улучшения трансмукозального переноса препаратов и особенно катионных веществ. К тому же, что немаловажно, снижение pH на ГП потенциально может способствовать снижению абсорбции катионов на недосыщенных кальций-зависимых сайтах в межклеточных эпителиальных контактах, таких как десмосомы, что может улучшать проникновение активных веществ и через эпителиальный барьер [15].

Однако снижение pH на глазной поверхности необходимо строго контролировать. Существует некоторый диапазон pH, воспринимаемый глазом как физиологически комфортный, отчасти благодаря гетерогенности pH слезной пленки на микролокальном уровне, где водная фракция с pH около 6,76 покрыта липидным слоем, контактирующим с внешней средой, а муциновая фракция с pH около 7,26 расположена ближе к эпителиальным клеткам [16]. Именно этот диапазон считается безопасным с точки зрения минимального раздражающего эффекта. Учитывая чувствительность нервных окончаний эпителия роговицы и конъюнктивы к снижению pH за рамками этого диапазона, необходимо обеспечить максимально быстрый и устойчивый возврат к физиологическому pH ГП. В противном случае можно ожидать раздражение, дискомфорт, болезненность и чрезмерное слезотечение, что существенно снижает удержание активных веществ на поверхности глаза и эффективность доставляемых препаратов.

Собственные буферные системы глаза не способны обеспечить максимально быстрое восстановление физиологического pH после инстилляции кислых растворов (например, pH ≈4,8): несмотря на активацию эндогенных механизмов, лишь частичное восстановление pH происходит через 5—10 мин, а полное — только спустя 40 мин [17]. В таких условиях требуется введение экзогенных буферов. Проблема включает в себя два ключевых аспекта: проблему диапазона регуляции (необходимость обеспечивать изменение pH в пределах широкого диапазона) и проблему скорости восстановления (необходимость максимально быстрого восстановления pH). Стандартные «жесткие» буферы офтальмологических препаратов, обыкновенно удерживающие pH в узком интервале для поддержания стабильности активного вещества, не позволяют обеспечить переход в рамках широкого диапазона pH из кислой области к физиологичным значениям [18]. А существующие многоступенчатые динамические решения [19], несмотря на способность контролировать более широкий диапазон pH, действуют слишком медленно и не обеспечивают необходимую скорость восстановления физиологического pH сразу после инстилляции.

Носитель на основе перегруженного pH-буфера как возможное решение проблем доставки офтальмологических препаратов

Перспективным представляется путь модуляции pH в области кислых-нейтральных значений как средство временного снижения барьерной функции муцинового и эпителиального слоев. Однако для клинического применения критически важно обеспечить не только снижение pH, но и его быстрый, стабильный возврат к физиологически комфортным значениям — задача, которую современные фармацевтически приемлемые офтальмологические носители пока не решают.

Мы предлагаем использовать носитель на основе перегруженного pH-буфера, т.е. композицию, в которой буферная система, номинально рассчитанная на поддержание pH в физиологическом диапазоне (от 6,6 до 7,8), преднамеренно выводится за пределы своего рабочего диапазона добавкой избытка кислоты, превышающего буферную емкость. Благодаря этому достигается «стартовый» pH композиции, который потенциально будет способствовать «открытию» муцинов и межэпителиальных контактов, а также трансмукозальному и трансэпителиальному переносу катионных активных веществ. Ожидается, что при контакте с анионными группами муцинов и эпителия избыток протонов быстро израсходуется, что возвратит буферную компоненту носителя в пределы рабочего диапазона, являющегося физиологичным. Это восстановит структуру глазной поверхности, обеспечит комфорт и не допустит элиминации активного лекарственного вещества. Таким образом, будет реализован динамически управляемый процесс, включающий почти мгновенное открытие муцинового и эпителиального барьеров, эффективное проникновение активного лекарственного вещества и последующее быстрое восстановление структуры муцинового слоя с одновременной нормализацией гомеостаза глазной поверхности.

В связи с этим ставится цель настоящего исследования — создание и изучение фармацевтически приемлемого носителя на основе перегруженного pH-буфера с возможностью динамической регуляции кислотности ГП для обеспечения эффективного и безопасного трансмукозального и трансэпителиального переноса инстилляционных катионных, нейтральных лекарственных веществ и наночастиц.

Материал и методы

Для получения предварительных данных о сравнительной эффективности предлагаемого носителя мы выбрали ионы меди (Cu²⁺), обладающие высокой аффинностью к муцину [20], и ионы неодима (Nd³⁺), селективно связывающиеся с плотными контактами эпителиальных клеток [21]. Физико-химические свойства выбранных модельных катионов затрудняют их прохождение через барьеры в нейтральных физиологических условиях.

Вариант носителя на основе перегруженного боратного pH-буфера со стартовым pH 6,4

Был приготовлен водный раствор кислотно-солевой смеси с содержаниями компонентов: NaCl — 4,17 г/л; Na₂B₄O₇ — 1,34 г/л; H₃BO₃ — 4,92 г/л; KCl — 0,35 г/л; CaCl₂·2H₂O — 0,23 г/л; MgCl₂·6H₂O — 0,14 г/л; Na(CH₃COO)·3H₂O — 2,63 г/л. Добавлением избытка соляной кислоты в количестве, превышающем емкость боратного буфера, pH смеси довели до 6,4. Результирующая величина осмолярности составила 380 мОсм/л.

Носитель на основе стандартного фосфатно-солевого буфера

В качестве контрольного носителя в исследовании использовали стандартный фосфатно-солевой буфер (PBS), полученный из коммерческой смеси PBS (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Раствор готовили согласно инструкции производителя.

Модельные растворы с катионами

После изготовления растворов-носителей на их основе были сформированы 4 тестируемых состава. Так, 2 состава были получены за счет прибавления сульфата меди (Copper(II) sulfate, anhydrous; Sigma-Aldrich, St Louis, USA) до достижения концентрации меди 1 мг/л: «H-buffer+Cu» — носитель на основе перегруженного pH-буфера с ионами меди; «PBS+Cu» — фосфатно-солевой раствор с ионами меди. И еще 2 состава были получены прибавлением одной объемной части раствора NdCl₃ (раствор 1 из набора BioREE-A производства ООО «Глаукон», Россия) к 9 частям каждого из носителей: «H-buffer+Nd» — носитель на основе перегруженного pH-буфера с ионами неодима; «PBS+Nd» — фосфатно-солевой раствор с ионами неодима.

Группы модельных животных

В рамках предварительного экспериментального исследования использовали 6 кроликов породы советская шиншилла. Животные были распределены на 4 группы в зависимости от инстиллируемых составов:

— группа I, опытный состав «H-buffer+Cu» — 2 кролика;

— группа II, контрольный состав «PBS+Cu» — 2 кролика;

— группа III, опытный состав «H-buffer+Nd» — 1 кролик;

— группа IV, контрольный состав «PBS+Nd» — 1 кролик.

Инстилляции выполняли 1 раз в сутки в правый глаз, левый глаз служил интактным контролем. Период наблюдения составил 1 мес для групп с Cu («H-buffer+Cu» и «PBS+Cu») и 1 нед для групп с Nd («H-buffer+Nd» и «PBS+Nd»).

После завершения периода инстилляций животное выводили из эксперимента. Глаза изолировали, выделяли цельную роговицу.

Атомно-абсорбционная спектроскопия

Количество накопившейся в строме роговицы меди для групп «H-buffer+Cu» и «PBS+Cu» определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Изолированные роговицы разрезали послойно с выделением стромальной части. Для минимизации риска металлической контаминации использовали сапфировый нож. Образцы замораживали при –60 °C, высушивали лиофильно при 10 Па в течение 1,5 ч. После высушивания взвешивали и вскрывали химически по азотно-кислой схеме с перекисью водорода (два этапа, 1 сут).

Для количественного определения содержания меди в тканях роговицы использовали атомно-абсорбционный спектрометр «Квант.Z» (ООО «КОРТЭК», Россия). Среднюю концентрацию меди в финальном образце определяли по результатам 5 измерений с вычислением стандартного отклонения. Концентрацию пересчитывали на вес исходной роговицы до ее обезвоживания.

Сканирующая электронная микроскопия и полуколичественный химический микроанализ на энергодисперсионном спектрометре

В группах «H-buffer+Nd» и «PBS+Nd» изолированные роговицы подвергали лиофилизации, затем разрезали перпендикулярно с формированием сагиттальных срезов. Полученный срез роговицы размещали на специальном столике типа «тиски», фиксируя плоскостью среза вверх, и помещали в камеру сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).

Визуализацию и анализ осуществляли посредством СЭМ Zeiss EVO 10 (Германия), оснащенным катодом LaB6. Использовали режим низкого вакуума (70 Pa) при ускоряющем напряжении от 20 до 25 кВ. Вели детекцию обратнорассеянных электронов (BSE). Полуколичественный химический микроанализ проводили на базе микроскопа СЭМ Zeiss EVO 10, используя энергодисперсионный спектрометр (ЭДС) Zeiss SmartEDX. Измеряли долю выборочных химических элементов: C, N, O, Na, Mg, Al, P, S, Cl, K, Ca, Nd. Для этого на каждом образце под визуальным контролем выбирали по 17 участков в разных частях стромы роговицы, результат спектрометрии которых приводили к медиане.

Биомикроскопия

Для оценки состояния переднего отрезка глаза у кроликов проводили биомикроскопию с фоторегистрацией, используя модифицированную щелевую лампу Takagi SM-2N (Япония). Исследования выполняли в следующие временные точки: до первой инстилляции, затем через 15 и 60 мин после инстилляции в 1-й день, а также ежедневно до окончания срока эксперимента (1 мес для групп «H-buffer+Cu» и «PBS+Cu»; 1 нед для групп «H-buffer+Nd» и «PBS+Nd»).

Визуально подтверждали отсутствие дефектов роговицы и видимых признаков воспалительного процесса структур переднего отрезка глаза.

Результаты

Накопление меди в строме при использовании разных фармацевтических носителей для инстилляций

Данные атомно-абсорбционной спектроскопии показывают, что использование носителя на основе перегруженного pH-буфера в глазных каплях увеличивает в 1,6 раза среднее содержания Cu в строме роговицы (рис. 1). В группе «H-buffer+Cu» средняя концентрация меди в строме роговицы составила 0,54 мг/кг, что превышает показатели в группе контроля — 0,33 мг/кг («PBS+Cu»). В интактном контроле (глаз, не подвергавшийся инстилляциям) среднее содержание меди было ниже и составило 0,26 мг/кг.

Рис. 8. Сопоставление морфологических типов идиопатических эпиретинальных мембран с клиническими стадиями идиопатического эпиретинального фиброза по Govetto.

Накопление неодима в строме при использовании разных фармацевтических носителей для инстилляций

Использование в глазных каплях носителя на основе перегруженного pH-буфера статистически значимо (p<0,001, критерий Манна—Уитни) увеличивало концентрацию Nd³⁺ в строме роговицы по сравнению с показателями контроля (рис. 2). Мы установили, что в строме роговицы глаза, на поверхность которого проводили инстилляции тестируемого носителя на основе перегруженного pH-буфера, медиана доли Nd составила 0,39 вес.% [0,36 вес.%; 0,43 вес.%]. В строме роговицы глаза, на поверхность которого инстиллировали состав с PBS (группа «PBS+Nd»), измеряемая доля Nd составила всего 0,07 вес.% [0,07 вес.%; 0,08 вес.%], что формально было ниже, чем предел обнаружения энергодисперсионного детектора (составляющий 0,1 вес.%). В интактном контроле (левый глаз кроликов без инстилляций) неодим по данным ЭДС не определялся.

Рис. 2. Весовая доля неодима (Nd) в строме роговицы (в вес.%) по данным энергодисперсионного спектрометра (ЭДС) после инстилляций.

Для группы III — Nd³⁺ с носителем на основе перегруженного pH-буфера (фиолетовый бокс), для группы IV — Nd³⁺ с PBS (белый бокс). Красной линией показан предел обнаружения для ЭДС.

Биомикроскопия

При биомикроскопическом исследовании ни в одной из групп не было выявлено признаков раздражения или повреждения переднего сегмента глаза как во время эксперимента, так и по завершении всего периода инстилляций. Конъюнктивальная гиперемия оставалась на уровне 0 баллов по шкале 0—3 во все пункты наблюдения. Целостность роговичного эпителия оценивалась как 0 баллов (дефекты не выявлены) на всех временных точках. Таким образом, биомикроскопические данные подтверждают отсутствие механических или токсических поражений глазной поверхности при применении носителя на основе перегруженного pH-буфера.

Обсуждение

В настоящем исследовании приводятся предварительные результаты тестирования принципиально нового фармацевтического носителя для инстилляционных офтальмологических препаратов — системы на основе перегруженного pH-буфера. Проблема, которую он призван решить, заключается в эволюционно сформированных защитных барьерах глаза (слезной пленке с муциновым слоем и эпителии роговицы), чья основная функция — предотвращение проникновения чужеродных молекул, включая потенциально опасные катионы, в ткани глаза. Однако именно эта функция представляет серьезное препятствие для эффективной доставки ряда офтальмологических препаратов, особенно катионных и нейтральных молекул, обладающих высоким сродством к компонентам этих барьеров.

Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что разработанный нами носитель на основе перегруженного pH-буфера обеспечивает значительное усиление трансмукозального переноса активных веществ через барьеры в строму роговицы. Мы наблюдали 1,6-кратное увеличение в строме афинных к муцинам веществ (на примере Cu²⁺) при применении новационной химической композиции по сравнению с PBS-контролем. Также носитель на основе перегруженного pH-буфера решает довольно сложную проблему трансэпителиального переноса. Тесты показали, что концентрация в строме афинных к эпителию веществ (на примере Nd³⁺) при использовании созданного нами состава приближается к половине весового процента в пересчете на сухое вещество стромы роговицы, тогда как при использовании PBS их уровень в строме ниже порога детекции (<0,1 вес. %).

В современных лекарственных формах разработчики нередко вынуждены использовать агрессивные усилители проницаемости, такие как поверхностно-активные вещества, хелаторы кальция или катионные полимеры, применение которых, несмотря на временное повышение биодоступности действующего вещества, часто сопровождаются раздражением, повреждением тканей и нарушением физиологического гомеостаза глазной поверхности. Более того, стремление стабилизировать офтальмологические препараты за счет «жестких» экзогенных буферных систем, удерживающих pH раствора в оптимальном для лекарственного агента диапазоне, зачастую приводит к использованию слишком подкисленных глазных капель, приводящих к раздражению глазной поверхности и снижению комплаентности терапии. В отличие от агрессивных усилителей проницаемости применение носителя на основе перегруженного pH-буфера не сопровождалось признаками раздражения или повреждения тканей.

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что носитель на основе перегруженного pH-буфера не только повышает локальную биодоступность активных веществ, но и снижает риск токсического воздействия на глазную поверхность.

Принцип работы предлагаемого носителя на основе перегруженного pH-буфера базируется на управляемом снижении pH поверхности глаза. Протоны избыточной кислоты реализуют низкий «стартовый» pH композиции, но быстро расходуются на подавление мукозального и эпителиального барьера. При этом номинальное значение буферной системы носителя находится в рамках физиологического диапазона.

В первые секунды после инстилляций подкисление глазной поверхности приводит к ослаблению электростатических и ковалентных взаимодействий в муцинах, т.е. «открытию» муцинового барьера, что облегчает трансмукозальный перенос активного компонента офтальмологического препарата. Дополнительно реализуется механизм ослабления связывания катионов на кальций-зависимых участках эпителиальных соединений, что облегчает и трансэпителиальный перенос. При этом в процессе взаимодействия с муциновым слоем избыток протонов быстро расходуется и pH глазной поверхности за счет буферной компоненты носителя быстро возвращается в физиологический диапазон, при котором муцины вновь формирует плотный гель, в том числе препятствующий элиминации препарата.

Такой динамический цикл «открытие—закрытие» позволяет кратковременно и обратимо снизить барьерную функцию муцина и эпителия для эффективного проникновения лекарств, а затем восстанавливает исходное состояние барьеров глазной поверхности. Таким образом реализуется управляемый механизм, объединяющий быстрое проникновение лекарств через муцины и эпителий и последующую стабилизацию барьеров, что существенно повышает локальную биодоступность препарата при минимизации как его вымывания, так и токсического воздействия.

В качестве модельных катионных веществ мы выбрали ионы меди (Cu²⁺) и неодима (Nd³⁺), поскольку их физико-химические свойства позволяли имитировать ключевые взаимодействия лекарственных молекул с барьерами глазной поверхности. Ионы Cu²⁺ демонстрируют высокую аффинность к муцину [20], что делает их идеальным инструментом для моделирования адгезии лекарственных агентов к муциновому слою. В то же время ионы Nd³⁺ обладают способностью изоморфно замещать Ca²⁺ в Ca-зависимых контактных соединениях эпителия (на кадгеринах в десмосомах), обеспечивая селективное связывание с плотными межклеточными контактами эпителия [21]. Такой выбор позволил нам оценить эффективность преодоления действующими веществами обоих барьеров — муцинового и эпителиального — и подтвердить, что наш носитель на основе перегруженного pH-буфера улучшает трансмукозальный и трансэпителиальный перенос.

Это свидетельствует о высоком потенциале разработанного подхода для доставки офтальмологических агентов, характеризующихся ограниченной проницаемостью через трансмукозальные и трансэпителиальные барьеры, либо молекул, стабильных исключительно при низких pH. Такие вещества были уже упомянуты нами во введении и включают в себя катионные офтальмологические препараты (пилокарпин, тимолол, гентамицин, офлоксацин, тобрамицин и др.), а также некоторые нейтральные молекулы, такие как дексаметазон.

В настоящем исследовании мы предложили новый принцип взаимодействия офтальмологического препарата со структурами ГП и привели данные предварительного тестирования одного из вариантов, основанного на боратной буферной системе. Использование различных буферных систем и их сочетаний, а также настройка «стартовой» pH для препаратов позволят создавать разнообразные варианты носителей на основе предложенной концепции — заведомо перегруженного pH-буфера.

Очевидно, что физико-химические характеристики каждого действующего вещества будут влиять на эффективность его транспорта и накопления при использовании предложенного типа носителей. Поэтому каждая фармакологическая молекула, предполагаемая к использованию с одним из подобных носителей, должна быть протестирована индивидуально. В дальнейших исследованиях помимо набора статистических данных необходимо детально изучить распределение и безопасность различных соединений при использовании фармацевтических носителей нового типа.

Заключение

Предложен принципиально новый фармацевтический носитель на основе перегруженного pH-буфера. Новационная химическая композиция предполагает динамическое изменение pH глазной поверхности после инстилляции, что, в свою очередь, обеспечивает физиологичное и значимое усиление трансмукозального и трансэпителиального переноса катионных веществ без повреждения тканей глаза. Этот подход позволит повысить биодоступность лекарственных средств, уменьшить необходимую исходную дозу активных компонентов в лекарственных формах, снизить токсическую нагрузку на глаз за счет снижения собственной токсичности лекарственного препарата и устранения необходимости применения токсичных улучшителей проницаемости в лекарственных формах.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Новиков И.А., Кузнецов С.В., Осипян Г.А., Суббот А.М., Патеюк Л.С.

Сбор и обработка материала: Новиков И.А., Пак О.А., Новикова А.И., Кравчик М.В., Билялов А.И.

Статистическая обработка: Новиков И.А., Кравчик М.В.

Написание текста: Кравчик М.В.

Редактирование: Гусев О.А., Аветисов С.Э., Юсеф Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.