Воздействие антисептиков на эпителиальные клетки роговицы и конъюнктивы человека in vitro

В лечении инфекционно-воспалительных заболеваний глаз широко используются различные группы лекарственных средств для местного применения, преимуществами которых являются простота изготовления, удобство в использовании, скорость наступления терапевтического эффекта и биодоступность [1]. Выбор лекарственного средства, его формы и схемы применения обусловлен этиологией, тяжестью заболевания, чувствительностью возбудителя к препарату и т.д. В зависимости от этих факторов могут быть назначены антибиотики, противовирусные, антимикотические и антисептические глазные капли [2—4]. На сегодняшний день на фармацевтическом рынке представлено множество противомикробных препаратов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки [5].

Внедрение в офтальмологическую практику антисептиков позволило существенно повысить эффективность лечения инфекционно-воспалительных заболеваний глаз, поскольку эта группа препаратов обладает широким спектром активности и высоким противомикробным потенциалом [6]. Антисептики также эффективны в отношении вирусов, грибов, простейших, их применяют как в амбулаторной практике, так и в условиях хирургического стационара [2, 3, 7, 8] — для профилактики послеоперационных осложнений [9], лечения конъюнктивитов [3], блефаритов [10], дакриоциститов [7], кератитов, язв роговицы [8, 11], эпителиопатий роговицы при ношении контактных линз [12], кератоувеитов [13].

В настоящее время в терапии инфекционно-воспалительных заболеваний глаз предпочтение отдается официнальным однокомпонентным антисептическим глазным каплям «Витабакт», «Бактавит», «Пикторид-солофарм» (действующее вещество — производное бигуанидов пиклоксидина гидрохлорид 0,05%) и «Окомистин» (действующее вещество — бензилдиметил-миристоиламино-пропиламмоний 0,01%, принадлежащий к группе поверхностно-активных веществ и относящийся к четвертичным аммониевым соединениям). Антисептические глазные капли, обеспечивая максимально возможный терапевтический эффект за счет высокой антимикробной активности (что было подтверждено результатами наших исследований по изучению сравнительной чувствительности глазных капель «Витабакт» и «Окомистин» в отношении грамположительных и грамотрицательных возбудителей [14]), должны также обладать минимальным повреждающим действием на клетки глазной поверхности [15].

Препараты данной группы, как правило, являются нетоксичными для тканей кожных покровов и слизистых оболочек, так как они более устойчивы к повреждающему действию антисептиков, чем ткани внутренних органов, что дает возможность использовать их в более высоких концентрациях [16]. Однако данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что длительное применение препаратов местного использования может вызывать нежелательные изменения глазной поверхности, связанные с дискомфортом, воспалением, нестабильностью слезной пленки, потерей бокаловидных клеток, плоскоклеточной метаплазией конъюнктивы, апоптозом конъюнктивального эпителия и субконъюнктивальным фиброзом. В связи с этим следует обратить внимание на целесообразность рационального выбора лекарственных средств, которые могут вызвать нежелательные реакции со стороны макроорганизма. Для этого предлагается использовать различные модели, в том числе тест-системы на основе клеточных культур, позволяющие выбрать оптимальный способ введения, подобрать дозу препарата, что необходимо для повышения соотношения «польза/риск» [17].

Учитывая высокую потребность в эффективных и безопасных антисептических глазных каплях для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний и опираясь на опыт предыдущих работ по изучению цитотоксичности различных групп глазных лекарственных форм на клеточных культурах [18, 19], мы провели исследование по оценке цитотоксического действия антисептических глазных капель с использованием культивируемых клеток.

Цель работы — оценить в условиях in vitro воздействие антисептических глазных капель на клетки эпителия роговицы и конъюнктивы.

Исследуемые препараты. Объектом исследования являлись три антисептика в форме глазных капель: «Бактавит», «Витабакт» (пиклоксидина гидрохлорид) и «Окомистин» (бензилдиметил-миристоиламино-пропиламмоний).

Используемые клеточные культуры. В качестве тест-систем были использованы иммортализованные линии клеток эпителия роговицы человека (HCE) и конъюнктивы человека (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4).

Стандартные условия культивирования. Клетки культивировали при 37 °C в CO₂-инкубаторе в атмосфере 5% CO₂ в соответствующих питательных средах, содержащих 10% FBS (HyClone, США). Для клеток линии HCE использовали среду Keratinocyte-SFM (Gibco, США), для клеток линии Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4 — среду Игла МЕМ («Биолот», Россия).

Дизайн и методы исследования. Влияние антисептических глазных капель на жизнеспособность эпителиальных клеток роговицы, конъюнктивы изучали в условиях in vitro в процессе культивирования клеток в соответствующих питательных средах, содержащих исследуемые препараты. Контролем служили клетки, культивируемые в стандартных условиях без добавления препаратов. Выбор концентрации антисептиков для эксперимента базировался на данных клинического использования исследуемых препаратов и собственных исследований цитотоксичности глазных капель на клеточных культурах [18, 19]. Жизнеспособность клеток оценивали по их метаболической активности и морфологии с использованием МТТ-теста и методов фазово-контрастной микроскопии.

Для оценки методом МТТ влияния антисептиков на жизнеспособность эпителиальных клеток роговицы и конъюнктивы человека клетки высевали в 96-луночные планшеты в 200 мкл соответствующей питательной среды, содержащей исследуемые препараты в концентрации 2% от объема среды, и культивировали в обычном режиме в течение 2 сут. По истечении срока культивирования проводили анализ МТТ. Оптическую плотность растворов измеряли с помощью анализатора Fluorofot «Charity» (Россия) при длине волны 570 нм и референсной длине волны 630 нм. Математическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Exel 2007. Различия считали значимыми при p<0,05.

Морфологическое состояние клеток в процессе их культивирования с исследуемыми препаратами оценивали при помощи инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS100 (Япония), оснащенного фотокамерой.

В процессе культивирования клеток линий Chang Conjunctiva, Clone 1-5с-4 и HCE в соответствующих питательных средах, содержащих 2% глазных антисептических капель, проводилась оценка их морфологического состояния. Данные этого прижизненного наблюдения, полученные на 3-и сутки культивирования, приведены на рис. 1. На представленных микрофотографиях клетки эпителия роговицы и конъюнктивы в контрольном варианте (без добавления антисептиков) хорошо распластаны, имеют типичную эпителиоподобную морфологию и на 3-и сутки культивирования сформировали конфлюэнтный монослой. В присутствии всех исследуемых антисептиков в концентрации 2% от объема питательной среды клетки обоих типов адгезировали и распластались, однако плотного монослоя не сформировали. Кроме того, были выявлены различия в морфологическом состоянии клеток и степени формирования монослоя в зависимости от типа клеток и тестируемого антисептика. Так, в присутствии препаратов «Бактавит» и «Витабакт» клетки обоих типов сформировали субконфлюэнтный монослой, однако морфологическое состояние клеток в присутствии этих препаратов отличается от контроля. Большая часть клеток распластаны, вместе с тем встречаются округлые и истонченные клетки. Структура клеток зернистая, в межклеточном пространстве также выявлены зернистые артефакты, которые могут являться продуктами нарушенного клеточного обмена. Наиболее выраженными эти морфологические изменения оказались у клеток эпителия роговицы. В присутствии препарата «Окомистин» морфологическое состояние адгезировавших клеток было наиболее близко к контролю, но при этом выявлялось много округлившихся клеток. Кроме того, на 3-и сутки культивирования монослой у Chang Conjunctiva, Clone 1-5с-4 и HCE оказался сформированным лишь на 50%. Установлено, что препарат «Окомистин», введенный в состав питательной среды в момент посева клеток, оказал существенное ингибирующее влияние на адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток роговицы и конъюнктивы.

Рис. 1. Морфология эпителиальных клеток иммортализованных линий конъюнктивы (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4) и роговицы (HCE) человека на 3-и сутки культивирования в питательной среде, содержащей 2% исследуемых антисептиков, добавленных в среду в момент посева клеток.

Фазово-контрастная микроскопия. Ув. 20.

С помощью колориметрического метода с использованием МТТ-теста были получены количественные данные по процентному соотношению жизнеспособных клеток в эксперименте и контроле. Результаты МТТ-теста представлены в виде гистограмм, где жизнеспособность клеток, культивируемых в питательных средах с добавлением антисептических капель, выражена в процентах по отношению к контролю (рис. 2).

Рис. 2. Гистограмма оценки жизнеспособности эпителиальных клеток иммортализованных линий конъюнктивы (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4) и роговицы (HCE) человека на 3-и сутки культивирования в питательной среде, содержащей 2% исследуемых антисептиков, добавленных в среду в момент посева клеток. МТТ-тест.

МТТ-тест позволяет оценить суммарную активность дыхательных ферментов митохондрий. Он основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в кристаллы пурпурного формазана, который с помощью органических растворителей переводят в раствор. Интенсивность окраски раствора линейно коррелирует с количеством жизнеспособных клеток. Последующая спектрофотометрия позволяет точно сопоставить значение оптической плотности экспериментальной пробы по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить гибель клеток, индуцированную тем или иным химическим агентом.

По данным МТТ-теста, количество жизнеспособных клеток эпителия роговицы и конъюнктивы в присутствии всех исследуемых антисептиков было ниже, чем в контроле. Наименьшее количество жизнеспособных клеток детектировано при культивировании в среде, содержащей препарат «Окомистин», при этом последний оказал одинаковое цитотоксическое действие как на HCE, так и на Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4. В то же время клетки эпителия роговицы оказались более чувствительными к воздействию препаратов «Бактавит» и «Витабакт», чем клетки конъюнктивы. Наименьшее токсическое действие в отношении культивируемых клеток, по данным МТТ-теста, проявил препарат «Витабакт». Результаты МТТ-теста сопоставимы с результатами прижизненного наблюдения за морфологическим состоянием клеток в процессе их культивирования.

Под воздействием различных веществ, входящих в состав глазных капель, клетки глазной поверхности могут менять морфологию, скорость клеточного роста, время гибели, степень дезинтеграции, поэтому тестирование их влияния на выживаемость клеток является целесообразным и оправданным [20]. В настоящем исследовании представлены сравнительные результаты оценки цитотоксичности антисептических глазных капель, содержащих в качестве активного вещества пиклоксидин гидрохлорид («Витабакт» и «Бактавит») и бензилдиметил-миристоиламино-пропиламмоний («Окомистин»).

Антисептические капли «Окомистин» принадлежат к группе препаратов, содержащих в своем составе поверхностно-активные вещества. Некоторые из них (октенисепт, полигексаметилен бигуанид, хлоргексидин биглюконат), как показали исследования, могут оказывать цитотоксическое действие на эпителиальные клетки глазной поверхности, подавляя их пролиферацию, приводя к дефектам или повреждению эпителия роговицы, особенно в высоких концентрациях, стимулируя апоптоз и вызывая аутофагическую/некротическую гибель клеток [21, 22]. Имеются данные, что препарат «Окомистин» способен оказывать цитотоксическое действие на клеточные культуры, снижая синтез ДНК в ядрах эпителиальных клеток роговицы крыс и индекс пролиферации клеток, при этом повышая уровень фрагментации ДНК в ядрах эпителиальных клеток, по сравнению с контролем, что свидетельствует о проапоптотическом действии антисептика, содержащего мирамистин [16]. В основе антимикробной активности действующего вещества (бензилдиметил-миристоиламино-пропиламмоний хлорид моногидрат) лежит прямое взаимодействие молекулы препарата с белково-липидными комплексами мембран микроорганизмов, при этом часть молекулы антисептика погружается в липофильный слой мембраны, разрыхляет ее и повышает проницаемость для крупномолекулярных веществ, что приводит к угнетению жизнеспособности и разрушению микробной клетки. [6]. По данным других авторов, обладая высокой избирательностью действия в отношении микроорганизмов, антисептик не оказывает влияния на эпителиальные клетки глазной поверхности [2, 23] и даже может стимулировать реэпителизацию роговицы [24]. Такая избирательность, видимо, связана с различием в структуре клеточных мембран эукариотических и микробных клеток.

Пиклоксидина гидрохлорид относится к катионным антисептикам из ряда бигуанидов. Молекула антисептика несет положительный заряд, который способствует электростатическому связыванию с отрицательно заряженными группами на клеточных стенках микроорганизмов с последующим нарушением барьеров проницаемости бактериальных клеток [25]; это было подтверждено экспериментальным исследованием, в котором пиклоксидин электростатически связывается с отрицательно заряженной поверхностью бактериальных клеток грамположительных коагулазонегативных стафилококков, вызывая нейтрализацию поверхностного заряда бактерий, их агрегацию, оказывая деструктивное действие на клеточную стенку микроорганизмов [15].

Информация о влиянии пиклоксидина гидрохлорида на культивируемые эукариотические клетки в доступной литературе практически отсутствует. В единичных публикациях представлены данные о токсичности антисептика «Витабакт» in vitro в отношении клеточной культуры Vero. С помощью МТТ-теста было установлено, что подавление жизнеспособности клеток наблюдалось в присутствии препарата «Витабакт» в питательной среде в разведении от 1:2 до 1:64, а при более высоких разведениях препарата (от 1:128 и выше) его цитотоксического действия в отношении клеток не зарегистрировано [26]. Заслуживает внимания работа, в которой представлены данные, полученные при изучении морфологической структуры ткани глаза крыс после проведения форсированных инстилляций раствора пиклоксидина на роговицу животных [27]. Через 1 ч после закапывания отмечалось снижение плотности клеток заднего эпителия роговицы и появлялась фиброваскулярная ткань в передней камере глаза, при этом видимых изменений в переднем и заднем эпителии роговицы и строме выявлено не было.

Таким образом, результаты наших исследований, а также данные отечественной и зарубежной литературы свидетельствуют, что антисептические глазные капли, принадлежащие к различным группам химических веществ, могут индуцировать цитотоксическое действие на клетки эпителия роговицы (HCE) и конъюнктивы человека (Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4) в разной степени, приводя к морфологическим и функциональным изменениям клеток.

Антисептические глазные капли «Бактавит», «Витабакт» и «Окомистин» оказывают различное воздействие на клетки эпителия роговицы и конъюнктивы в условиях in vitro. Наименее токсичным из исследованных антисептиков в отношении культивируемых клеток, по данным МТТ-теста, оказался «Витабакт»: при культивировании в среде, содержащей этот антисептик, детектировано наибольшее число жизнеспособных клеток. При этом клетки эпителия роговицы человека НСЕ оказались более чувствительными к воздействию данного препарата, чем клетки конъюнктивы человека Chang Conjunctiva, Clone 1-5c-4. Напротив, различий в чувствительности этих типов клеток к воздействию препарата «Окомистин» выявлено не было, а при их культивировании в среде, содержащей данный антисептик, детектировано наименьшее количество жизнеспособных клеток. Проведенное исследование показало принципиальную возможность использования культивируемых клеток для сравнительной оценки цитотоксического действия антисептических офтальмологических препаратов in vitro в целях повышения соотношения «польза/риск» при профилактике и терапии инфекционно-воспалительных заболеваний глаз, позволяя рационально использовать глазные капли, обладающие высоким антибактериальным потенциалом и низкой цитотоксичностью. Данное направление становится все более актуальным и требует проведения дальнейших исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Э.А., И.О.

Сбор и обработка материала: Д.П., Ю.Г., К.Ж.

Статистическая обработка: Д.П.

Написание текста: Э.А., И.О.

Редактирование: Э.А., И.О., М.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.