Сафонова Т.Н.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Зайцева Г.В.

ФГБНУ «НИИ глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, 119021, Российская Федерация

Логинов В.И.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», ул. Балтийская, 8, Москва, 125315, Российская Федерация

Бурденный А.М.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», ул. Балтийская, 8, Москва, 125315, Российская Федерация

Лукина С.С.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», ул. Балтийская, 8, Москва, 125315, Российская Федерация; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России», ул. Большая Пироговская, 2, стр. 4, Москва, 119435, Российская Федерация

Взаимосвязь полиморфизмов гена TRIM21 с тяжестью сухого кератоконъюнктивита при ревматоидном артрите и болезни Шегрена

Журнал: Вестник офтальмологии. 2019;135(5): 192-198

Просмотров : 36

Загрузок : 234

Как цитировать

Сафонова Т. Н., Зайцева Г. В., Логинов В. И., Бурденный А. М., Лукина С. С. Взаимосвязь полиморфизмов гена TRIM21 с тяжестью сухого кератоконъюнктивита при ревматоидном артрите и болезни Шегрена. Вестник офтальмологии. 2019;135(5):192-198. https://doi.org/10.17116/oftalma2019135052192

Авторы:

Сафонова Т.Н.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (5)

Распространенность аутоиммунных заболеваний (АИЗ) среди взрослого населения России, по данным Министерства здравоохранения РФ, составляет около 1%. Первое место по заболеваемости занимают болезнь Шегрена (БШ) и ревматоидный артрит (РА), связующим звеном которых является офтальмопатия в виде сухого кератоконъюнктивита (СКК), который констатируют у 80—90% пациентов с БШ и 25—30% больных Р.А. Выделяют три степени СКК, которые обусловлены клинико-функциональными изменениями. Для Р.А. более характерна тяжелая степень заболевания, нередко осложняющаяся развитием язвы роговицы [1]. Причем поражение глаз тесно связано с интегральными клиническими признаками течения заболевания, такими как: степень активности патологического процесса, темпы прогрессирования артрита, частота поражения грудиноключичных, верхнечелюстных, лучезапястных и локтевых суставов, развитие дигитального артериита, изменения скелетных мышц и легких, возникновение системного остеопороза, асептического некроза костей [2].

Многочисленными исследованиями этиопатогенеза БШ и РА доказано, что данные заболевания имеют также и генетически обусловленную природу, связанную с присутствием в генотипе определенных аллельных вариантов генов (THBS1, GTF2I, MUC1, TRIM21, STAT4, PTPN22), продукты которых прямо или опосредованно участвуют в регуляции иммунного ответа [3—14]. В работе A. Lee было показано, что мутации в гене TRIM21 встречаются наиболее часто и коррелируют со степенью тяжести основного заболевания. Это явилось предпосылкой для исследования полиморфизмов данного гена и его ассоциации с повреждением глазной поверхности [15]. Трехсторонний мотив-содержащий белок 21, также известный как E3 убиквитин-белковая лигаза TRIM21, представляет собой белок, который у человека кодируется геном TRIM21. В качестве альтернативы были описаны сплайсированные варианты транскриптов для этого гена, но был определен полноразмерный характер только одного. TRIM21 является эффектором внутриклеточного антитела во внутриклеточном антитело-опосредованном пути протеолиза. Он распознает Fc-домен и связывается с иммуноглобулином G и М на антителах. TRIM21 является частью рибонуклеопротеина Ro/SSA, который включает в себя один полипептид и одну из четырех небольших молекул РНК. Частица Ro/SSA локализуется как в цитоплазме, так и в ядре. Ro/SSA взаимодействует с аутоантигенами у пациентов с синдромом Шегрена. M. Al-Majdoub и соавторы определяли аутоантитела, реагирующие с белком TRIM21, которые обнаружены у 70% пациентов с первичным синдромом Шегрена (в отечественной классификации — болезнь Шегрена) [16—19]. В сыворотке пациентов с БШ были обнаружены аутоантитела к другим белкам TRIM, но их клиническая значимость пока остается неясной. Авторы проводили поиск частоты встречаемости анти-TRIM38 у пациентов с БШ и оценку его взаимосвязи с различными клиническими проявлениями заболевания. TRIM38-реактивные аутоантитела, которые перекрестно реагируют с TRIM21, были обнаружены в сыворотке у 24 из 235 пациентов с БШ и 2 из 50 контрольных. Обнаружение анти-TRIM38 коррелировало с наличием анти-Ro60, анти-Ro52, анти-La, ревматоидного фактора и гипергаммаглобулинемией [20]. Ro52 функционирует как убиквитин-лигаза E3 [21] и участвует в убиквитинировании регуляторного фактора интерферона (IRF) 3 и стимуляции IRF7 и toll-like рецептора (TLR), обеспечивая регуляцию активности иммунной системы [22—24]. Ro52 может также опосредованно действовать на апоптоз и как цитозольный рецептор Fc для IgG. Он связывает различные изотипы иммуноглобулинов для антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN) и протеасомной деградации вирусов [25]. Анти-Ro/SSA антитела представляют собой два различных вида аутоантител, которые реагируют с двумя негомологичными белками, Ro52/TRIM21 и Ro60/TROVE2 соответственно. Ro52/TRIM21 — это трехсторонний мотив-содержащий белок, который выступает в качестве внутриклеточных Fc-рецепторов и Е3-убиквитин-протеин лигазы. Он участвует в регуляции клеточной пролиферации, активации индуцированной клеточной гибели, а также в регулировании TLR сигнализации и последующей по полиубиквитин-опосредованной деградации ИФН [26]. Протеин Ro60/TROVE2 способствует сохранению целостности клеток после ультрафиолетового (УФ) облучения, возможно, помогая в распаде УФ-индуцированной поврежденной РНК. С другой стороны, La/SSB, по-видимому, также является РНК-связывающим белком, участвующим в различных аспектах метаболизма РНК. Он сопровождает или связывается с молекулами-предшественниками РНК, чтобы защитить их от нуклеазо-опосредованного распада и ускорить их созревание [27].

Клинически наличие анти-TRIM38 ассоциируется с более выраженной эпителиопатией глазной поверхности, гиполакримией и уменьшением количества малых слюнных желез. Аффинно очищенные антитела к доменам TRIM38-CortBP-2 и TRIM38-B30.2/SPRY подвергаются взаимодействию с TRIM21. Определение анти-TRIM38 специфично для пациентов с БШ и коррелирует со степенью тяжести заболевания [6].

Цель исследования — определение взаимосвязи полиморфных маркеров rs7947461 (C/T), rs915956 (C/T), rs4144331 (C/A) гена TRIM21 со степенью тяжести СКК у больных РА и БШ.

Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента Р.Ф. от 24.12.93 № 2288).

В исследование включено 70 пациентов (6 мужчин, 64 женщины) в возрасте от 35 до 72 лет (средний возраст 53,5 года), которым был верифицирован диагноз РА (n=27) и БШ (n=43) и установлен диагноз СКК: легкой степени — 15 больным, средней — 18, тяжелой — 37. Стадию СКК определяли на основании клинико-функционального обследования, включавшего стандартные и дополнительные офтальмологические обследования: тест Ширмера I, II, пробу Норна, определение осмолярности слезы («Tearlab Osmolarity system», СШA), тесты с витальными красителями, которые оценивали по Оксфордской шкале, импрессионно-цитологическое исследование, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (HRT III RCM, Германия), ОКТ с менискометрией (RTVue 100−2/CA «Optovue», СШA). Критериями исключения были обострение хронических, воспалительных процессов, наследственные и психические заболевания. Группу контроля (n=35) составили добровольцы без АИЗ в анамнезе и отягощенной наследственности, сопоставимые по полу и возрасту с пациентами исследуемой группы. Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеинкиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре –20 °С.

Для поиска и анализа полиморфизмов в исследуемом гене была использована комбинация двух методов: анализ кривых плавления и метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПДРФ-анализа, (RFLP — restriction fragment length polymorphism).

Идентификацию аллелей полиморфного маркера С660Т rs7947461 гена TRIM21 проводили с помощью метода ПЦР-ПДРФ. Для ПЦР использовали олигонуклеотиды, взятые из: TRIM21-F: CTGTACATCCACAGTGAGC и TRIM21-R: CATCCCTTGTCAGATGGATAG [18]. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис — HCl (рН=8,8), 16,6 мМ сульфат аммония, Tween-20 0,01%, 2,0 мМ MgCl2, 100 нг геномной ДНК и рекомбинантную термостабильную ДНК-полимеразу Taq 0,1 ед/мкл. Амплификацию выполняли по программе: 95 °С — 2 мин; 35 циклов 92 °С — 10 c; Тотж — 20 с; 72 °С — 10 с и 72 °С — 2 мин на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия). Далее амплифицированный фрагмент ДНК гена TRIM21 подвергали обработке с использованием эндонуклеазы BglII («СибЭнзим», Россия) в объеме 20 мкл в рекомендованном производителем буфере в течение 16 ч. Проверку полноты расщепления ДНК рестриктазами осуществляли путем расщепления 1 мкг фага лямбда за 1 ч. Для продукта амплификации использовали трехкратное количество фермента. Фрагменты ДНК после рестрикции разделяли в 2% агарозном геле в горизонтальной камере с использованием в качестве электродного буфера 1хТАЕ при напряженности поля 10 В/см с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете при длине волны 254 нм. Методом ПДРФ-анализа было установлено, что у носителей аллеля Т фрагмент ДНК полиморфного маркера С660Т rs7947461 гена TRIM21 имеет размер 420 п.н., в то время как у носителей аллеля С фрагмент ДНК имеет размер 255 и 165 н.п. У носителей гетерозиготного генотипа выявляются все три фрагмента — 420, 255, 165 п.н. (рис. 1).

Рис. 1. Анализ полиморфного маркера С660Т гена TRIM21 в 2% агарозном геле методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Идентификацию аллелей полиморфного маркера rs915956 (C/T) и rs4144331 (C/A) гена TRIM21 выполняли с помощью метода: анализ кривых плавления ДНК (High Resolution Melting Point Analysis (HRM) (рис. 2).

Рис. 2. Анализ мутации rs915956 (C/T) в гене TRIM21 с использованием кривых плавления.
При работе использовали набор qPCRmix-HS SYBR, предназначенный для ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I, в соответствии с протоколом производителя («Евроген», Россия). ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1х qPCRmix-HS SYBR, по 0,4 мкМ каждого праймера, 50—100 нг ДНК матрицы; в 96-луночных планшетах Optical Reaction Plate на амплификаторе BioRad CFX96 qPCR System (Bio-Rad, США) по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 95 °С, 5 мин; ПЦР: 40 циклов (95 °С — 30 c; 58 °С — 30 с; 72 °С — 30 с). Плавление продуктов амплификации производили в диапазоне 55—95 °C с увеличением температуры на 0,5°С каждые 10 с (см. рис. 2). Обработка полученных данных осуществлена в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad) (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры для гена TRIM21

Статистическую обработку результатов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди—Вайнберга для аутосомных признаков. Комплексная оценка связей между контрольной и исследуемыми группами заключалась в использовании логистической регрессии, определяя отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI) с уровнем значимости, равным 0,05. При сопоставлении генотипов и клинических проявлений учитывали степень тяжести СКК. Для статистического анализа данных использовали систему Statistica 6.1 RUS.

У пациентов с легкой и средней степенью тяжести СКК достоверной ассоциации с полиморфными маркерами гена TRIM21 установлено не было (p=0,2—0,69; OR=0,28—10,14). Сопоставление распределения частот генотипов полиморфных маркеров rs7947461 (C/T), rs915956 (C/T), rs4144331 (C/A) гена TRIM21 у больных с тяжелой степенью СКК и контрольной группы обоими методами не выявило статистически значимых различий для полиморфного маркера rs915956 (C/T). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs4144331 (C/A) и rs7947461 (C/T) гена TRIM21 в группе больных с тяжелой степенью СКК и контрольной группе представлено в табл. 2 и на

Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs915956 (C/T), rs4144331 (C/A) и rs7947461 (C/T) гена TRIM21 у пациентов с СКК и в контрольной группе
рис. 3.
Рис. 3. Распределение частот генотипов полиморфных маркеров rs7947461 (C/T) и rs4144331 (C/A) гена TRIM21 в контрольной группе и группе больных с сухим кератоконъюнктивитом.

Для предрасполагающего генотипа (TT) полиморфного маркера rs7947461 гена TRIM21 выявлена ассоциация с риском развития тяжелой степени СКК. Его частота в исследуемой группе в 2,6 раза превысила показатели в группе контроля (χ2=6,34), а относительный риск развития тяжелой степени СКК увеличивался в 3,6 раза (OR=3,65, CI95%=1,15—11,61; p=0,04). Частота предрасполагающего аллеля в группе больных с СКК была статистически выше, чем в контрольной группе (χ2=7,27; OR=2,5, CI95%=1,27—4,89; p=0,007).

Следует особо подчеркнуть, что предрасполагающий генотип АА полиморфного маркера rs4144331 гена TRIM21 был обнаружен только в исследуемой группе пациентов с тяжелой степенью СКК (χ2=7,74; OR=17,46, CI95%=1,96—318,38; p=0,02). В исследуемой группе частота предрасполагающего аллеля оказалась выше в 3,0 раза по сравнению с группой контроля (χ2=8,71). Относительный риск развития тяжелой степени СКК повышался в 3,81 раза (OR=3,81, CI95%=1,51—9,62; p=0,003).

В настоящей работе изучена роль трех полиморфных маркеров гена TRIM21, определяющих степень тяжести СКК. Анализ литературных источников показал, что на сегодняшний день аналогичные исследования отсутствуют. Впервые получены результаты ассоциации двух полиморфных маркеров rs7947461 (OR=3,65; p=0,04) и rs4144331 (OR=17,46; p=0,02) с риском развития тяжелой степени СКК. При легкой и средней степени тяжести СКК данная взаимосвязь не установлена. Возможно, это связано с малой выборкой больных. Для увеличения статистической мощности работы необходимо изучение данных полиморфных маркеров на большей выборке пациентов, что позволило бы экстраполировать результаты в других популяциях мира.

Полученные данные открывают новые перспективы для предиктивного генетического тестирования предрасположенности к СКК. Полиморфизмы не являются непосредственной и обязательной причиной развития патологического процесса, но могут обусловливать больший или меньший риск его возникновения при действии различных внешних факторов. Выявленные особенности могли бы быть использованы при разработке современных методов прогнозирования, профилактики, а также для формирования групп риска пациентов с БШ и РА.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.С., Г. З.

Сбор и обработка материала: Г. З.

Статистическая обработка: Г. З., С.Л.

Написание текста: Т.С., Г. З.

Редактирование: Т.С., В.Л., А.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Сафонова Татьяна Николаевна — канд. мед. наук, вед. науч. сотр. отдела патологии слезного аппарата ФГБНУ НИИ ГБ; e-mail: safotat@mail.ru

Зайцева Галина Валерьевна — аспирант; e-mail: privezentseva.galya@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8575-3076

Логинов Виталий Игоревич — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии»; e-mail: loginov7w@gmail.com

Бурденный Алексей Михайлович — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии»; e-mail: burdennyy@gmail.com

Лукина Светлана Сергеевна — студент ФГАОУ ВО «Первый МГМУ»; e-mail: sveta_sergeevna349@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Зайцева Галина Валерьевна — e-mail: privezentseva.galya@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8575-3076

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail