Кислотность и буферная система глазной поверхности (по данным исследования конъюнктивальной полости)

Кислотно-щелочное равновесие является одним из параметров гомеостаза в организме человека. Клетки и ткани человеческого организма чувствительны к изменениям кислотности: только в определенном диапазоне колебаний pH поддерживается стабильность молекулярных структур и активность ферментов. Доказана необходимость поддержания кислотности сред организма в допустимых пределах и существенная роль изменений данного показателя в патогенезе ряда заболеваний [1].

Часто употребляемый в специальной литературе термин «глазная поверхность» подразумевает группу образований (роговица, конъюнктива, слезный аппарат и веки), составляющую единую анатомо-функциональную систему. Конъюнктива как слизистая оболочка характеризуется определенным значением pH, обеспечивающим поддержание физиологичного функционирования глазной поверхности.

Значение pH слезы глаза у человека по разным данным составляет от 6,5 до 7,8, причем средние значения в отдельных исследованиях варьируют от 6,93 до 7,45 [2-7]. Зоной комфорта глазной поверхности условно считают диапазон pH 6,6-7,8 [8]. Смещение pH за пределы комфортного диапазона вызывает ощущение дискомфорта, характерного для ряда заболеваний [6, 9, 10]. Стабильный уровень физиологичного для конъюнктивальной полости pH необходимо учитывать в медицинских препаратах, растворах для контактных линз (КЛ) и косметических средствах во избежание возникновения раздражения, дискомфорта и развития патологических изменений структур глазной поверхности.

Ранее были выявлены изменения pH при ношении КЛ и таких заболеваниях, как стеноз слезоотводящих путей, кератит и синдром сухого глаза, а также в послеоперационном периоде после пересадки роговицы [6, 9]. Принимая во внимание изменчивость кислотности при различных заболеваниях глаз, данный параметр можно рассматривать как сопутствующий клинический признак или диагностический критерий.

Кислотность слезы рассматривают в качестве патогенетической составляющей в развитии кератоконуса (КК). При исследовании слезы были получены предварительные данные об изменении ее кислотности при развитии КК. Это позволило авторам связать щелочной сдвиг pH слезы с аномальным распределением элементов халькофильной группы в тканях роговицы и предложить принципиально новый патогенетический механизм развития КК [10].

Среди методов измерения, применявшихся разными авторами, превалирует ионно-электролитическая pH-метрия с использованием стеклянных микроэлектродов [2-6]. В конъюнктивальной полости содержится 6-7 мкл (0,006-0,007 мл) слезной жидкости, а слезная пленка имеет толщину 6-12 мкм, что делает затруднительным измерение pH при помощи стеклянных микроэлектродов непосредственно со слезной пленки, так как велика вероятность аппликации микроэлектрода на конъюнктиву. При этом может регистрироваться pH не слезной жидкости, а эпителия конъюнктивы.

Единичные работы посвящены изучению влияния состава слезы на ее pH. Согласно одной из гипотез, бикарбонатный (гидрокарбонатный) буфер предложено рассматривать в качестве системы, поддерживающей pH слезы в диапазоне физиологических значений [5, 11].

Цель исследования - на основании разработанных методик измерения кислотности и оценки минеральных компонентов слезной жидкости изучить распределение значений pH слезы конъюнктивальной полости и возможные механизмы поддержания ее нормальной кислотности.

Для определения физиологической нормы кислотности слезы был проведен анализ pH у 42 здоровых лиц (84 глаза). Возрастно-половой состав группы: 13 мужчин и 29 женщин в возрасте от 19 до 24 лет. У 25 пациентов (28 глаз, 8 мужчин и 17 женщин в возрасте от 20 до 24 лет) в образцах было выявлено слизистое отделяемое.

Измерение pH проводили по ранее описанным методикам при помощи лакмусовых тест-полосок [12-14] высокой чувствительности с возможным диапазоном измерений 6,4-8,0 и интервалом 0,2 ед. pH. Слезную жидкость получали с помощью тест-полоски путем однократного касания конъюнктивы в нижнем своде. Оценку результатов осуществляли через 1-4 мин после забора слезы на фильтровальную бумагу. В течение этого времени окрашивание индикаторной полоски было стабильным, что было подтверждено многократным последовательным анализом активированной тест-полоски. Для объективизации анализа индикаторной полоски стандартная методика была дополнена компьютерной колориметрической оценкой. Разработанная компьютерная программа позволила оценить pH в нескольких достаточно окрашенных для анализа участках тест-полосок. Калибровка результатов измерений была проведена при помощи стандартных буферных растворов с pH 7,01 и 6,86; воспроизводимость измерений по максимальному разбросу значений составила ΔpH=0,024.

Для изучения возможных механизмов поддержания нормальной кислотности слезной жидкости был проведен микрохимический анализ восьми проб слезной жидкости восьми здоровых лиц (8 глаз). Возрастно-половой состав группы: 3 мужчин и 5 женщин в возрасте от 21 года до 28 лет. Забор материала производили при помощи микропипетки из зоны слезного ручья «в одно касание», что значительно снижало ответную реакцию в виде рефлекторной секреции. Пробы материала высушивали в контейнере на токопроводящей углеродной пленке в беспылевых условиях при относительной влажности 85% и температуре 18 °C до получения кристаллограмм. Далее пробы вакуумировали с целью их эвапорации и проводили электронно-зондовую микроскопию в комбинации с энергодисперсионной спектрометрией при помощи электронно-зондового микроанализатора JXA-8200 («JEOL Ltd.», Япония), оснащенного энергодисперсионным спектрометром (EDS). Изображения получали в отраженных электронах (BSE), вторичных электронах (SE) и в режиме построения микротопограмм поверхности (TOPO) с последующим элементным микрокартированием.

Ряд ранее проведенных исследований нормальной кислотности слезы свидетельствуют о весьма значительном разбросе pH [2-6]. Исходя из этого, можно предположить, что некоторые авторские методы измерения pH имели систематическую поправку, влияющую на показатели pH-метрии выборки в целом.

В отличие от pH-метрии с использованием стеклянных микроэлектродов лакмусовая проба дает представление не только о максимальных зарегистрированных в конъюнктивальной полости значениях кислотности, но и о распределении pH в пределах тест-полоски. Кроме того, данная методика позволяет дифференцированно измерять кислотность слезной жидкости (рис. 1)

В данном исследовании первоначально статистический анализ pH проводили без учета гетерогенности анализируемого материала. Выявлена полимодальность распределения кислотности с двумя основными максимумами частоты встречаемости pH: 6,74 и 7,30. Эти данные совпадают с результатами ранее проведенных исследований [2-7]. Не исключено, что некоторые исследователи либо методологически не получали, либо отбрасывали значения, соответствующие одной из полученных в нашем исследовании мод в комплексной выборке.

При повторном цифровом анализе было выявлено, что тест-полоски с высокими значениями pH имели выраженный гетерогенный характер, соответствовавший забору не только слезной жидкости, но и слизистого отделяемого, находившегося в нижнем конъюнктивальном своде. При этом pH слизистого отделяемого был существенно выше pH свободной жидкости. Слезная жидкость имела слабокислую реакцию, слизистое отделяемое - слабощелочную. При статистическом анализе было получено нормальное распределение Гаусса (р≤0,05) каждого их этих показателей среди здоровых лиц (рис. 3).

«Нормальные» показатели pH слезной жидкости варьировали от 6,30 и до 7,23 (среднее значение 6,76; мода 6,74). При сравнении значений pH правого (первого тестируемого) и левого (второго тестируемого) глаза достоверных различий не выявлено. Как уже указывалось выше, в процессе анализа активированных тест-полосок была выделена подгруппа пациентов, в чьих образцах оказалось слизистое отделяемое. Показатели pH слизистого отделяемого варьировали от 7,00 до 8,00 (среднее значение 7,26; мода 7,30). Различия в кислотности слезной жидкости и слизистого отделяемого составили от 0,12 до 1,10 ед. pH (в среднем 0,51 с модой 0,43). Достоверных различий в возрастно-половом составе между изучаемой группой и подгруппой пациентов, в чьих образцах оказалось слизистое отделяемое, не выявлено.

Значения pH собственно слезной жидкости практически соответствуют измерениям, указывающим на более кислый характер слезы [6]. Значения pH слизистого отделяемого соответствуют более щелочным измерениям [2, 5], что можно объяснить внедрением микроэлектродов в подлежащие свободной слезной пленке среды и ответным на механическое раздражение рефлекторным слезоотделением.

Известно, что pH межклеточной жидкости сопоставима с кислотностью крови 7,28-7,42 [1]. Исходя из этого, можно предположить, что конъюнктива имеет более щелочные значения pH, отличные от таковых поверхностных сред. Таким образом, в конъюнктивальной полости pH распределяется в соответствии с послойной зональностью структур, что можно рассматривать как основной фактор, влияющий на результаты контактных измерений.

С нашей точки зрения, кроме установленной зональности кислотности конъюнктивальной полости существует несколько дополнительных причин, оказывающих влияние на рН, в частности на рефлекторную слезопродукцию и травму эпителия конъюнктивы. Известно, что стимулирование слезопродукции ведет к изменению pH слезы [4]. Как правило, измерение при помощи pH-метра занимает несколько минут, что не исключает возможности рефлекторной секреции слезы, приводящей к систематической погрешности полученных результатов. Кислотность межклеточной жидкости и внутриклеточного содержимого, как правило, существенно отличается от pH поверхности органа или ткани, а также секретируемых ими веществ [1]. При измерении кислотности возможно повреждение эпителиоцитов как механически - микроэлектродами, так и физически - за счет возникающей на поверхности электрода разности потенциалов между стеклом и исследуемым веществом, что приводит к недостоверности результатов. Для более точного измерения кислотности слезы следует исключить травматизацию и раздражение конъюнктивы в процессе измерения pH и производить все манипуляции в пределах слезной жидкости. Влияние рефлекторной слезопродукции на результаты измерения pH при применении опробованной в данной работе методике минимизировано.

Кроме того, при оценке кислотности необходимо учитывать дополнительные параметры, влияющие на pH конъюнктивальной полости, - вегетативную иннервацию и циклические колебания. Колебания тонуса симпатической и парасимпатической нервной системы также влияют на продукцию слезы и ее компонентов, тем самым определяя ее физико-химические свойства [15]. Известно, что слеза базальной секреции в течение суток меняет свою кислотность. В утренние часы после продолжительного сна (закрытие глаз) слезная жидкость имеет pH меньше, чем в период бодрствования и в вечерние часы [2, 5]. Вероятно, существуют и другие типы цикличных изменений pH, например климатические или сезонные колебания.

Элементное картирование кристаллограмм слезной жидкости показало наличие органических и минеральных (неорганических) компонентов в ее составе (рис. 4).

В качестве физиологического механизма, обеспечивающего кислотно-основное равновесие в слезной жидкости, исследователи указывают на бикарбонатную (гидрокарбонатную) буферную систему [5, 11]. Молекулы угольной кислоты H2CO3 являются донором протона H⁺, а гидрокарбонат-анион HCO3^– выполняет роль акцептора протона H⁺:

H2CO3 ↔ H⁺ + HCO3^–.

В настоящем исследовании в кристаллограммах слезы не было выявлено карбонатов и фосфатов натрия, калия, кальция и магния, которые могли бы выполнять функции буферной системы слезы. В то же время отмечено значительное содержание бора - до 26,50 ат.% в фазе хлорида калия, что предполагает его существенную роль в поддержании нормального физиологического состояния слезы. Преимущественная ассоциация бора с хлоридом калия свидетельствует о том, что бор в слезе содержится в виде растворимых соединений борных кислот: ортоборной кислоты H3BO3 (или B(OH)3) или тетраборной кислоты H2B4O7.

Соли борной кислоты, в том числе в водных растворах, большей частью являются производными не ортоборной кислоты H3BO3, а тетраборной кислоты H2B4O7 [16] (т.е. дегидратированной ортоборной H3BO3):

8 H3BO3 ↔ 10 H2O + 2 H2B4O7.

В буферных растворах соли тетраборной кислоты (тетрабораты) присутствуют в виде гидратированного тетраборат-аниона [B4O5(OH)4]^2– [17]:

H2B4O7 + 2 H2O ↔ 2 H⁺ + [B4O5(OH)4]^2–,

где гидратированный тетраборат-анион выступает в роли акцептора протона H⁺, а тетраборная кислота играет роль донора протона H⁺.

Полученные результаты и выводы согласуются с положениями общей химии (разделы «Основные типы химических равновесий и процессов» и «Протолитические буферные системы»). Известно, что зона буферного действия бикарбонатной буферной системы соответствует pH 5,4-7,4 [18]. Исходя из этого, кислотно-основное состояние слезной жидкости при pH>7,4 не может поддерживаться данной системой. В то же время боратная буферная система на основе гидратированного тетраборат-аниона имеет зону буферного воздействия pH 7,6-9,2 [19].

Кроме того, необходимо учитывать данные о содержании гидрокарбонат-аниона HCO3^– в составе слезы [20], роль которого в поддержании кислотно-основного состояния слезной жидкости спорна [5, 11]. Бикарбонатная буферная система, по сути, представляет собой водный раствор, состоящий из смеси угольной кислоты H2CO3 и ее соли в виде гидрокарбонат-аниона HCO3^– [18]. При повышении pH (снижении кислотности и уменьшении содержания протонов водорода H⁺) угольная кислота H2CO3 диссоциирует с образованием протонов H⁺ (H2CO3 ↔ H⁺ + HCO3^–), тем самым снижая pH до поддерживаемого кислотно-основного состояния раствора. При снижении pH (повышении кислотности, увеличении содержания протонов водорода H⁺) гидрокарбонат-аниона HCO3^– реагирует с протоном H⁺ с образованием угольной кислоты H2CO3 (H⁺ + HCO3^– ↔ H2CO3), тем самым повышая pH до поддерживаемого кислотно-основного состояния раствора.

При эвапорации растворенная в воде угольная кислота разлагается на углекислый газ и воду:

H2CO3 ⇒ CO2 ↑ + H2O,

а растворенные в воде соли угольной кислоты (гидрокарбонаты) кристаллизуются:

HCO3^– + Na⁺ ⇒ NaHCO3 ↓,

HCO3^– + K⁺ ⇒ NaHCO3 ↓.

Таким образом, отсутствие кристаллизованных гидрокарбонатов в кристаллограммах слезной жидкости косвенно свидетельствует об отсутствии гидрокарбонат-аниона HCO3^–, ассоциированного со щелочным катионом натрия или калия как компонента бикарбонатного буфера, а соответственно и самой бикарбонатной буферной системы.

Ранее уже отмечалась нестабильность предполагаемой бикарбонатной буферной системы слезы в зависимости от концентрации углекислого газа в слезе при открытых и закрытых глазах [5]. Это объясняется тем, что глазная поверхность контактирует с окружающей средой, а происходящий газообмен между слезой и воздухом зависит от длительности периодов сна и бодрствования, актов моргания и газового состава атмосферного воздуха. Соответственно, содержание углекислого газа и карбонатов в слезе непрерывно меняется.

Учитывая представленные в данной работе факты и наблюдения, на наш взгляд, можно рассматривать возможную боратную буферную систему как наиболее стабильную составляющую механизма поддержания кислотно-основного баланса глазной поверхности.

Следует отметить, что наличие бора в составе слезы было установлено на основании косвенных данных, полученных при помощи физического метода исследования, не являющегося прямым методом химического анализа. Учитывая вышесказанное, а также малые количества анализируемого вещества, нельзя считать наличие бора абсолютно доказанным. Поэтому данный вопрос требует дальнейшего изучения с использованием других методов элементного анализа.

1. Разработанная методика pH-метрии позволяет достоверно оценивать кислотность конъюнктивальной полости в соответствии с зональностью и гетерогенностью ее сред и сложной структурной организацией слезной пленки.

2. В популяции здоровых людей кислотность слезной жидкости достоверно отличается от кислотности слизистого отделяемого конъюнктивальной полости.

3. Минеральный компонент слезы представлен преимущественно растворимыми соединениями хлора, натрия, калия и бора.

4. Боратная буферная система представляется наиболее стабильной составляющей механизма поддержания нормального кислотно-основного состояния слезы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А., Т.С., И.Н.

Сбор и обработка материала: Т.С., И.Н., Л.П., И.Г.

Статистическая обработка данных: И.Н.

Написание текста: Т.С., И.Н., Л.П., И.Г.

Редактирование: С.А.

Конфликт интересов отсутствует.