Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Сафонова Т.Н.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Новиков И.А.

Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России, Москва, Россия

Патеюк Л.С.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Грибоедова И.Г.

ФГБУ "Институт геологии и рудных месторождений, петрографии, минералогии и геохимии" РАН (ФГБУ ИГЕМ РАН)

Кислотность и буферная система глазной поверхности (по данным исследования конъюнктивальной полости)

Журнал: Вестник офтальмологии. 2014;130(5): 5-10

Просмотров : 260

Загрузок :

Как цитировать

Аветисов С. Э., Сафонова Т. Н., Новиков И. А., Патеюк Л. С., Грибоедова И. Г. Кислотность и буферная система глазной поверхности (по данным исследования конъюнктивальной полости). Вестник офтальмологии. 2014;130(5):5-10.

Авторы:

Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (5)

Кислотно-щелочное равновесие является одним из параметров гомеостаза в организме человека. Клетки и ткани человеческого организма чувствительны к изменениям кислотности: только в определенном диапазоне колебаний pH поддерживается стабильность молекулярных структур и активность ферментов. Доказана необходимость поддержания кислотности сред организма в допустимых пределах и существенная роль изменений данного показателя в патогенезе ряда заболеваний [1].

Часто употребляемый в специальной литературе термин «глазная поверхность» подразумевает группу образований (роговица, конъюнктива, слезный аппарат и веки), составляющую единую анатомо-функциональную систему. Конъюнктива как слизистая оболочка характеризуется определенным значением pH, обеспечивающим поддержание физиологичного функционирования глазной поверхности.

Значение pH слезы глаза у человека по разным данным составляет от 6,5 до 7,8, причем средние значения в отдельных исследованиях варьируют от 6,93 до 7,45 [2-7]. Зоной комфорта глазной поверхности условно считают диапазон pH 6,6-7,8 [8]. Смещение pH за пределы комфортного диапазона вызывает ощущение дискомфорта, характерного для ряда заболеваний [6, 9, 10]. Стабильный уровень физиологичного для конъюнктивальной полости pH необходимо учитывать в медицинских препаратах, растворах для контактных линз (КЛ) и косметических средствах во избежание возникновения раздражения, дискомфорта и развития патологических изменений структур глазной поверхности.

Ранее были выявлены изменения pH при ношении КЛ и таких заболеваниях, как стеноз слезоотводящих путей, кератит и синдром сухого глаза, а также в послеоперационном периоде после пересадки роговицы [6, 9]. Принимая во внимание изменчивость кислотности при различных заболеваниях глаз, данный параметр можно рассматривать как сопутствующий клинический признак или диагностический критерий.

Кислотность слезы рассматривают в качестве патогенетической составляющей в развитии кератоконуса (КК). При исследовании слезы были получены предварительные данные об изменении ее кислотности при развитии КК. Это позволило авторам связать щелочной сдвиг pH слезы с аномальным распределением элементов халькофильной группы в тканях роговицы и предложить принципиально новый патогенетический механизм развития КК [10].

Среди методов измерения, применявшихся разными авторами, превалирует ионно-электролитическая pH-метрия с использованием стеклянных микроэлектродов [2-6]. В конъюнктивальной полости содержится 6-7 мкл (0,006-0,007 мл) слезной жидкости, а слезная пленка имеет толщину 6-12 мкм, что делает затруднительным измерение pH при помощи стеклянных микроэлектродов непосредственно со слезной пленки, так как велика вероятность аппликации микроэлектрода на конъюнктиву. При этом может регистрироваться pH не слезной жидкости, а эпителия конъюнктивы.

Единичные работы посвящены изучению влияния состава слезы на ее pH. Согласно одной из гипотез, бикарбонатный (гидрокарбонатный) буфер предложено рассматривать в качестве системы, поддерживающей pH слезы в диапазоне физиологических значений [5, 11].

Цель исследования - на основании разработанных методик измерения кислотности и оценки минеральных компонентов слезной жидкости изучить распределение значений pH слезы конъюнктивальной полости и возможные механизмы поддержания ее нормальной кислотности.

Материал и методы

Для определения физиологической нормы кислотности слезы был проведен анализ pH у 42 здоровых лиц (84 глаза). Возрастно-половой состав группы: 13 мужчин и 29 женщин в возрасте от 19 до 24 лет. У 25 пациентов (28 глаз, 8 мужчин и 17 женщин в возрасте от 20 до 24 лет) в образцах было выявлено слизистое отделяемое.

Измерение pH проводили по ранее описанным методикам при помощи лакмусовых тест-полосок [12-14] высокой чувствительности с возможным диапазоном измерений 6,4-8,0 и интервалом 0,2 ед. pH. Слезную жидкость получали с помощью тест-полоски путем однократного касания конъюнктивы в нижнем своде. Оценку результатов осуществляли через 1-4 мин после забора слезы на фильтровальную бумагу. В течение этого времени окрашивание индикаторной полоски было стабильным, что было подтверждено многократным последовательным анализом активированной тест-полоски. Для объективизации анализа индикаторной полоски стандартная методика была дополнена компьютерной колориметрической оценкой. Разработанная компьютерная программа позволила оценить pH в нескольких достаточно окрашенных для анализа участках тест-полосок. Калибровка результатов измерений была проведена при помощи стандартных буферных растворов с pH 7,01 и 6,86; воспроизводимость измерений по максимальному разбросу значений составила ΔpH=0,024.

Для изучения возможных механизмов поддержания нормальной кислотности слезной жидкости был проведен микрохимический анализ восьми проб слезной жидкости восьми здоровых лиц (8 глаз). Возрастно-половой состав группы: 3 мужчин и 5 женщин в возрасте от 21 года до 28 лет. Забор материала производили при помощи микропипетки из зоны слезного ручья «в одно касание», что значительно снижало ответную реакцию в виде рефлекторной секреции. Пробы материала высушивали в контейнере на токопроводящей углеродной пленке в беспылевых условиях при относительной влажности 85% и температуре 18 °C до получения кристаллограмм. Далее пробы вакуумировали с целью их эвапорации и проводили электронно-зондовую микроскопию в комбинации с энергодисперсионной спектрометрией при помощи электронно-зондового микроанализатора JXA-8200 («JEOL Ltd.», Япония), оснащенного энергодисперсионным спектрометром (EDS). Изображения получали в отраженных электронах (BSE), вторичных электронах (SE) и в режиме построения микротопограмм поверхности (TOPO) с последующим элементным микрокартированием.

Результаты и обсуждение

Ряд ранее проведенных исследований нормальной кислотности слезы свидетельствуют о весьма значительном разбросе pH [2-6]. Исходя из этого, можно предположить, что некоторые авторские методы измерения pH имели систематическую поправку, влияющую на показатели pH-метрии выборки в целом.

В отличие от pH-метрии с использованием стеклянных микроэлектродов лакмусовая проба дает представление не только о максимальных зарегистрированных в конъюнктивальной полости значениях кислотности, но и о распределении pH в пределах тест-полоски. Кроме того, данная методика позволяет дифференцированно измерять кислотность слезной жидкости (рис. 1)

Рисунок 1. Рис. 1. Результаты лакмусовой пробы образца свободной слезной жидкости. а - тест-полоска, пропитанная слезной жидкостью; б - «загрубленные» зоны цифрового измерения (pH 6,82).
и слизистого отделяемого (рис. 2)
Рисунок 2. Рис. 2. Результаты лакмусовой пробы образца свободной слезной жидкости со слизистым отделяемым. а - тест-полоска, пропитанная слезной жидкостью (1) и слизистым отделяемым (2); б - «загрубленные» зоны цифрового измерения (pH слезной жидкости 7,03, pH слизистого отделяемого 7,28).
, находившегося в момент забора материала в нижнем своде конъюнктивальной полости. Фильтровальная бумага тест-полоски обладает высокими капиллярно-адсорбционными свойствами, вследствие чего время забора материала и влияние рефлекторной секреции на результаты пробы сведены к минимуму. Анализируемый материал аппликационного теста был представлен исключительно содержимым конъюнктивальной полости с минимальным влиянием тканей конъюнктивы, которое сложно исключить при использовании стеклянных микроэлектродов.

В данном исследовании первоначально статистический анализ pH проводили без учета гетерогенности анализируемого материала. Выявлена полимодальность распределения кислотности с двумя основными максимумами частоты встречаемости pH: 6,74 и 7,30. Эти данные совпадают с результатами ранее проведенных исследований [2-7]. Не исключено, что некоторые исследователи либо методологически не получали, либо отбрасывали значения, соответствующие одной из полученных в нашем исследовании мод в комплексной выборке.

При повторном цифровом анализе было выявлено, что тест-полоски с высокими значениями pH имели выраженный гетерогенный характер, соответствовавший забору не только слезной жидкости, но и слизистого отделяемого, находившегося в нижнем конъюнктивальном своде. При этом pH слизистого отделяемого был существенно выше pH свободной жидкости. Слезная жидкость имела слабокислую реакцию, слизистое отделяемое - слабощелочную. При статистическом анализе было получено нормальное распределение Гаусса (р≤0,05) каждого их этих показателей среди здоровых лиц (рис. 3).

Рисунок 3. Рис. 3. Распределение pH свободной слезной жидкости и слизистого отделяемого.
Достоверность различий позволяет говорить о принципиальном расхождении pH между средами в конъюнктивальной полости.

«Нормальные» показатели pH слезной жидкости варьировали от 6,30 и до 7,23 (среднее значение 6,76; мода 6,74). При сравнении значений pH правого (первого тестируемого) и левого (второго тестируемого) глаза достоверных различий не выявлено. Как уже указывалось выше, в процессе анализа активированных тест-полосок была выделена подгруппа пациентов, в чьих образцах оказалось слизистое отделяемое. Показатели pH слизистого отделяемого варьировали от 7,00 до 8,00 (среднее значение 7,26; мода 7,30). Различия в кислотности слезной жидкости и слизистого отделяемого составили от 0,12 до 1,10 ед. pH (в среднем 0,51 с модой 0,43). Достоверных различий в возрастно-половом составе между изучаемой группой и подгруппой пациентов, в чьих образцах оказалось слизистое отделяемое, не выявлено.

Значения pH собственно слезной жидкости практически соответствуют измерениям, указывающим на более кислый характер слезы [6]. Значения pH слизистого отделяемого соответствуют более щелочным измерениям [2, 5], что можно объяснить внедрением микроэлектродов в подлежащие свободной слезной пленке среды и ответным на механическое раздражение рефлекторным слезоотделением.

Известно, что pH межклеточной жидкости сопоставима с кислотностью крови 7,28-7,42 [1]. Исходя из этого, можно предположить, что конъюнктива имеет более щелочные значения pH, отличные от таковых поверхностных сред. Таким образом, в конъюнктивальной полости pH распределяется в соответствии с послойной зональностью структур, что можно рассматривать как основной фактор, влияющий на результаты контактных измерений.

С нашей точки зрения, кроме установленной зональности кислотности конъюнктивальной полости существует несколько дополнительных причин, оказывающих влияние на рН, в частности на рефлекторную слезопродукцию и травму эпителия конъюнктивы. Известно, что стимулирование слезопродукции ведет к изменению pH слезы [4]. Как правило, измерение при помощи pH-метра занимает несколько минут, что не исключает возможности рефлекторной секреции слезы, приводящей к систематической погрешности полученных результатов. Кислотность межклеточной жидкости и внутриклеточного содержимого, как правило, существенно отличается от pH поверхности органа или ткани, а также секретируемых ими веществ [1]. При измерении кислотности возможно повреждение эпителиоцитов как механически - микроэлектродами, так и физически - за счет возникающей на поверхности электрода разности потенциалов между стеклом и исследуемым веществом, что приводит к недостоверности результатов. Для более точного измерения кислотности слезы следует исключить травматизацию и раздражение конъюнктивы в процессе измерения pH и производить все манипуляции в пределах слезной жидкости. Влияние рефлекторной слезопродукции на результаты измерения pH при применении опробованной в данной работе методике минимизировано.

Кроме того, при оценке кислотности необходимо учитывать дополнительные параметры, влияющие на pH конъюнктивальной полости, - вегетативную иннервацию и циклические колебания. Колебания тонуса симпатической и парасимпатической нервной системы также влияют на продукцию слезы и ее компонентов, тем самым определяя ее физико-химические свойства [15]. Известно, что слеза базальной секреции в течение суток меняет свою кислотность. В утренние часы после продолжительного сна (закрытие глаз) слезная жидкость имеет pH меньше, чем в период бодрствования и в вечерние часы [2, 5]. Вероятно, существуют и другие типы цикличных изменений pH, например климатические или сезонные колебания.

Элементное картирование кристаллограмм слезной жидкости показало наличие органических и минеральных (неорганических) компонентов в ее составе (рис. 4).

Рисунок 4. Рис. 4. Элементное картирование кристаллограмм слезной жидкости. а - электронно-зондовая микроскопия кристаллограммы слезы в режиме обратноотраженных электронов (BSE): серые кристаллы NaCl и белые кристаллы KCl; б - энергодисперсионный спектр твердой фазы с преимущественным содержанием NaCl; в - энергодисперсионный спектр твердой фазы с преимущественным содержанием KCl.
Среди минеральных (неорганических) составляющих были выявлены хлор, натрий, калий и бор, а также медь, кремний, сера, углерод и кислород в «следовых концентрациях». Минеральные продукты эвапорации слезы были представлены двумя твердыми фазами: с преимущественным содержанием хлорида калия и хлорида натрия. В составе кристаллов хлорида калия было выявлено наличие бора, концентрация которого в фазе варьировала от 7,9 до 26,5 ат.%. В составе кристаллов хлорида натрия также было выявлено наличие бора, концентрация которого в фазе варьировала от 0 до 18,0 ат.% (точность измерений соответствует полуколичественному химическому анализу). Необходимо учитывать, что концентрация бора может быть завышена в присутствии хлора.

В качестве физиологического механизма, обеспечивающего кислотно-основное равновесие в слезной жидкости, исследователи указывают на бикарбонатную (гидрокарбонатную) буферную систему [5, 11]. Молекулы угольной кислоты H2CO3 являются донором протона H+, а гидрокарбонат-анион HCO3 выполняет роль акцептора протона H+:

H2CO3 ↔ H+ + HCO3.

В настоящем исследовании в кристаллограммах слезы не было выявлено карбонатов и фосфатов натрия, калия, кальция и магния, которые могли бы выполнять функции буферной системы слезы. В то же время отмечено значительное содержание бора - до 26,50 ат.% в фазе хлорида калия, что предполагает его существенную роль в поддержании нормального физиологического состояния слезы. Преимущественная ассоциация бора с хлоридом калия свидетельствует о том, что бор в слезе содержится в виде растворимых соединений борных кислот: ортоборной кислоты H3BO3 (или B(OH)3) или тетраборной кислоты H2B4O7.

Соли борной кислоты, в том числе в водных растворах, большей частью являются производными не ортоборной кислоты H3BO3, а тетраборной кислоты H2B4O7 [16] (т.е. дегидратированной ортоборной H3BO3):

8 H3BO3 ↔ 10 H2O + 2 H2B4O7.

В буферных растворах соли тетраборной кислоты (тетрабораты) присутствуют в виде гидратированного тетраборат-аниона [B4O5(OH)4]2– [17]:

H2B4O7 + 2 H2O ↔ 2 H+ + [B4O5(OH)4]2–,

где гидратированный тетраборат-анион выступает в роли акцептора протона H+, а тетраборная кислота играет роль донора протона H+.

Полученные результаты и выводы согласуются с положениями общей химии (разделы «Основные типы химических равновесий и процессов» и «Протолитические буферные системы»). Известно, что зона буферного действия бикарбонатной буферной системы соответствует pH 5,4-7,4 [18]. Исходя из этого, кислотно-основное состояние слезной жидкости при pH>7,4 не может поддерживаться данной системой. В то же время боратная буферная система на основе гидратированного тетраборат-аниона имеет зону буферного воздействия pH 7,6-9,2 [19].

Кроме того, необходимо учитывать данные о содержании гидрокарбонат-аниона HCO3 в составе слезы [20], роль которого в поддержании кислотно-основного состояния слезной жидкости спорна [5, 11]. Бикарбонатная буферная система, по сути, представляет собой водный раствор, состоящий из смеси угольной кислоты H2CO3 и ее соли в виде гидрокарбонат-аниона HCO3 [18]. При повышении pH (снижении кислотности и уменьшении содержания протонов водорода H+) угольная кислота H2CO3 диссоциирует с образованием протонов H+ (H2CO3 ↔ H+ + HCO3), тем самым снижая pH до поддерживаемого кислотно-основного состояния раствора. При снижении pH (повышении кислотности, увеличении содержания протонов водорода H+) гидрокарбонат-аниона HCO3 реагирует с протоном H+ с образованием угольной кислоты H2CO3 (H+ + HCO3 ↔ H2CO3), тем самым повышая pH до поддерживаемого кислотно-основного состояния раствора.

При эвапорации растворенная в воде угольная кислота разлагается на углекислый газ и воду:

H2CO3 ⇒ CO2 ↑ + H2O,

а растворенные в воде соли угольной кислоты (гидрокарбонаты) кристаллизуются:

HCO3 + Na+ ⇒ NaHCO3 ↓,

HCO3 + K+ ⇒ NaHCO3 ↓.

Таким образом, отсутствие кристаллизованных гидрокарбонатов в кристаллограммах слезной жидкости косвенно свидетельствует об отсутствии гидрокарбонат-аниона HCO3, ассоциированного со щелочным катионом натрия или калия как компонента бикарбонатного буфера, а соответственно и самой бикарбонатной буферной системы.

Ранее уже отмечалась нестабильность предполагаемой бикарбонатной буферной системы слезы в зависимости от концентрации углекислого газа в слезе при открытых и закрытых глазах [5]. Это объясняется тем, что глазная поверхность контактирует с окружающей средой, а происходящий газообмен между слезой и воздухом зависит от длительности периодов сна и бодрствования, актов моргания и газового состава атмосферного воздуха. Соответственно, содержание углекислого газа и карбонатов в слезе непрерывно меняется.

Учитывая представленные в данной работе факты и наблюдения, на наш взгляд, можно рассматривать возможную боратную буферную систему как наиболее стабильную составляющую механизма поддержания кислотно-основного баланса глазной поверхности.

Следует отметить, что наличие бора в составе слезы было установлено на основании косвенных данных, полученных при помощи физического метода исследования, не являющегося прямым методом химического анализа. Учитывая вышесказанное, а также малые количества анализируемого вещества, нельзя считать наличие бора абсолютно доказанным. Поэтому данный вопрос требует дальнейшего изучения с использованием других методов элементного анализа.

Выводы

1. Разработанная методика pH-метрии позволяет достоверно оценивать кислотность конъюнктивальной полости в соответствии с зональностью и гетерогенностью ее сред и сложной структурной организацией слезной пленки.

2. В популяции здоровых людей кислотность слезной жидкости достоверно отличается от кислотности слизистого отделяемого конъюнктивальной полости.

3. Минеральный компонент слезы представлен преимущественно растворимыми соединениями хлора, натрия, калия и бора.

4. Боратная буферная система представляется наиболее стабильной составляющей механизма поддержания нормального кислотно-основного состояния слезы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А., Т.С., И.Н.

Сбор и обработка материала: Т.С., И.Н., Л.П., И.Г.

Статистическая обработка данных: И.Н.

Написание текста: Т.С., И.Н., Л.П., И.Г.

Редактирование: С.А.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail