Актуальность проведения клинико-иммунологических исследований при первичной открытоугольной глаукоме (ПОУГ) обусловлена неуклонным ростом числа больных с этой патологией, сложностью, неоднозначностью патогенеза заболевания, малой эффективностью лечения, а также современными представлениями о различных путях гибели клеток и возможности регулирования одного из них — апоптоза [2—5]. Нарушение процесса апоптоза при ПОУГ выявлено на уровне не только нейронов, но и клеток периферической крови [10—18]. Апоптоз, включаемый рецепторами плазматической мембраны, опосредуется специфическими взаимодействиями по типу рецептор—лиганд [6—8, 19, 20] (рис. 1).

Одним из мембранных клеточных рецепторов, ответственных за контролируемый тканевый гомеостаз и иммунный ответ, является белок с мол. массой 48 кД, получивший название Fas-рецептора (sFas/Apo-1). Кроме него на поверхности многих клеток, в том числе Т-лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов, тимоцитов и др., имеется другой мембранный белок с мол. массой 37 кД — Fas-лиганд (sFasL). Основным индуктором гибели клетки является sFasL, который стимулирует апоптоз в клетках, несущих специфические рецепторы к sFasL. Некоторые функциональные особенности белка заставляют предположить, что sFasL может быть вовлечен в патогенез повреждения клеток [8, 9].

Он принадлежит к семейству фактора некроза опухоли (ФНОα) и впервые был обнаружен на мембране активированных Т-лимфоцитов [6—8]. Нарушение физиологического равновесия между sFas/Apo-1 и его лигандом sFasL обусловливает участие данной системы (Fas/FasL), обладающей мощным апоптогенным потенциалом, в развитии многих патологических состояний. Поэтому уровень этих двух показателей принято рассматривать и оценивать в связи друг с другом.

Последние достижения в лечении нейродегенеративных заболеваний в сочетании с изучением патогенеза ПОУГ обосновывают необходимость поиска лекарственных средств, направленных на блокирование гибели нейронов сетчатки и зрительного нерва. Применяемые в настоящее время препараты (β-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, антиоксиданты, антиметаболиты, ноотропы, цитомедины, витамины и другие биологически активные вещества) позволяют проводить патогенетическую терапию целого ряда состояний, а изучение их воздействия в аспекте проблемы апоптоза открывает новые перспективы [1].

Цитиколин (CDP-choline) из группы ноотропов влияет на нейронную дегенерацию в гиппокампе крыс, вызванную интрагиппокампальной инъекцией β-амилоидного белка, снижает количество апоптозных клеток [9, 18, 21]. Это позволяет предположить, что цитиколин также может стимулировать регенерацию нейронов у пациентов с болезнью Альцгеймера [9, 18] и другими нейродегенеративными заболеваниями. В двух открытых испытаниях показано, что цитиколин восстанавливает связанное с глаукомой повреждение зрительного нерва [21].

Целью настоящего исследования явилось определение основных клеточных маркеров апоптоза sFas/Apo-1 и sFasL в сыворотке крови (СК) и слезной жидкости (СЖ) у пациентов с ПОУГ в зависимости от степени тяжести заболевания и изучение возможности фармакологической коррекции их ноотропным препаратом цитиколин.

Иммунологические исследования СК и СЖ проведены у 16 пациентов (9 мужчин, 7 женщин) в возрасте от 59 до 75 лет (средний возраст 67±8,4 года) с ПОУГ (22 глаза) различных стадий с компенсированным офтальмотонусом и у двух человек с подозрением на глаукому (4 глаза). Диагноз ПОУГ был подтвержден характерными периметрическими изменениями и результатами ретинотомографии. Компенсация внутриглазного давления (ВГД) была достигнута местной гипотензивной терапией и/или антиглаукоматозным вмешательством. Все пациенты были обследованы в динамике.

Иммуноферментным анализом (ИФА) с помощью коммерческих наборов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия) исследовали маркеры апоптоза sFas/Apo-1 и sFasL в СК и СЖ. Забор материала для исследования осуществляли до лечения и на следующий день после окончания курса терапии цитиколином. Препарат вводился в дозе 500 мг/сут внутривенно в течение 10 дней. На этапе клинического исследования особое внимание обращали на показатели остроты зрения, периметрические индексы статической автоматической периметрии (аппарат Octopus 101) и показатели ретинотомографии на HRT III (Heigelberg Retina Tomograph III).

Статистическая обработка данных выполнена с помощью программы Биостатд. Достоверность различий полученных значений определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты проведенного исследования позволяют оценить вклад sFas/Apo-1 и sFasL в патогенез ПОУГ, информативность исследованных тест-проб (СЖ и СК) и возможности лабораторного прогнозирования течения заболевания, а также влияние препарата цитиколина (парентерально) на изучавшиеся маркеры апоптоза и клинико-функциональные параметры.

Сравнительный анализ данных, полученных у больных с разными стадиями ПОУГ (см. таблицу),

У больных с I стадией ПОУГ при сохранении в СЖ высоких уровней sFas/Apo-1 и относительно низких sFasL отмечалась тенденция к повышению содержания обоих апоптотических маркеров в СК, вследствие чего разница между уровнями каждого из них в СЖ и СК уменьшилась. От предыдущей группы эти пациенты отличались главным образом значительным увеличением разрыва между содержанием sFas/Apo-1 и sFasL в СЖ (превышение первого в среднем более чем в 30 раз), а также в СК (в 10 раз соответственно).

Развитие глаукоматозного процесса (II—III стадии) ассоциировалось с заметным ослаблением секреции sFas/Apo-1 в СЖ и последовательным сокращением разрыва с этим показателем в СК (примерно в 4 раза). Параллельно этому на II стадии отмечалось повышение уровней sFasL в СЖ и особенно в СК, в результате чего превалирование sFas/Apo-1 над sFasL в обеих тест-пробах становилось менее выраженным, чем на начальных стадиях заболевания.

Переход в терминальную стадию сочетался с наиболее явным снижением уровней sFas/Apo-1 в СЖ (по сравнению с начальными стадиями, а также со II стадией ПОУГ) и фактическим сглаживанием разницы с содержанием его в СК, которое, напротив, имело тенденцию к повышению. Вероятно, последняя была связана с почти полным «истощением» в СК противоборствующего фактора — sFasL, что, в свою очередь, обусловило и увеличение разрыва между его содержанием в СК и СЖ. Следует отметить, что тенденция к снижению уровня sFasL на IV стадии ПОУГ (по сравнению со II) отмечалась и в СЖ, но она была выражена значительно слабее, чем в СК, и статистически не подтверждалась. Таким образом, отличительными особенностями IV стадии явились: локальный «дефицит» антиапоптогенного фактора sFas/Apo-1 и отсутствие разницы между его уровнями в СЖ и СК; усиление тенденции к превалированию апоптогенного фактора sFasL в СЖ вследствие «истощения» его в СК.

Следует отметить, что при анализе взаимосвязей между развитием ПОУГ и изменениями маркеров апоптоза явно выраженная однонаправленная динамика прослеживалась при определении sFas/Apo-1 в СЖ: планомерное снижение уровня по мере усугубления заболевания. Изменения трех других показателей (sFas/Apo-1 в СК, sFasL в СЖ и в СК) носили волнообразный характер и имели более сложную связь с клиникой.

При этом «локальной» особенностью (рис. 2)

Вектор «системных» показателей (рис. 3),

Таким образом, начальные стадии ПОУГ характеризовались локальным (СЖ) «противоборством» индуктора (sFasL) и ингибитора (sFas/Apo1) при параллельном системном (СК) усилении экспрессии обоих маркеров.

Прогрессирование заболевания ассоциировалось с ослаблением как sFas/Apo-1, так и sFasL, что, по-видимому, отражало тенденцию к «истощению» Fas-опосредованного звена апоптоза и возможный переход в следующую фазу апоптотического процесса с другими его маркерами. Характерно, что наиболее явное ослабление «позитивного» фактора (sFas/Apo-1) проявлялось главным образом на уровне глаза, а «негативного» (sFasL) — на системном уровне, что коррелировало с неблагоприятным развитием заболевания.

Патогенетическая роль обоих исследованных факторов апоптоза подтверждается и сопоставлением содержания их в СЖ с периметрическим параметром MD (рис. 4, 5).

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что исследование маркеров апоптоза в СЖ и СК может служить индикатором развития и прогрессирования ПОУГ, важным для понимания роли апоптотического процесса в патогенезе заболевания. Исходя из результатов нашей работы, влияние на течение ПОУГ оказывает как sFas/Apo-1 (антиапоптогенный фактор), так и его антагонист sFasL. Доминирующая роль при этом принадлежит местной секреции обоих факторов, в частности уровням и соотношению их в СЖ. Системная секреция sFas/Apo-1 и sFasL вне связи с локальной, по нашим наблюдениям, не играет существенной роли в развитии ПОУГ, но, по-видимому, может отразиться на его течении опосредованно, за счет соотношения с местной. Показано, что при угрозе заболевания происходит селективная локальная активизация защитного фактора (sFas/Apo-1). Она сохраняется и при начальных клинических проявлениях ПОУГ, дополняясь тенденцией к усилению его системной секреции, но с параллельным проявлением антагонистического фактора (sFasL). Дальнейшее развитие глаукоматозного процесса ассоциируется с сочетанным, локальным и системным усилением апоптогенного фактора (sFasL) при ослаблении (преимущественно на уровне глаза) антиапоптогенного (sFas/Apo-1). Переход в терминальную стадию оказался связан с явным местным «дефицитом» не только «позитивного» маркера (sFas/Apo-1), но и парадоксальным исчезновением «негативного» маркера (sFasL). Возможным объяснением этого феномена может явиться «истощение» обоих факторов и/или переход апоптотического процесса в стадию, связанную с другими его маркерами, которые в данной работе не исследовались.

Обобщение представленных данных свидетельствует о важной патогенетической роли двух взаимосвязанных маркеров апоптоза (sFas/Apo-1 и sFasL) и о принципиальной возможности прогнозирования риска возникновения и прогрессирования заболевания на основе определения их содержания в пробах СЖ и СК.

Наиболее информативным представляется исследование СЖ, особенно содержания в ней sFas/Apo-1, а также оценка соотношения между локальной и системной (кровь) секрецией этого антиапоптогенного фактора. Показано, что значительный подъем и превалирование содержания sFas/Apo-1 в СЖ может служить предиктором заболевания, а резкое снижение его уровня в СЖ и отсутствие различия с содержанием в СК — признаком перехода в наиболее тяжелую (IV) стадию ПОУГ. На начальной (I) и развитых стадиях (II и III) ПОУГ локальная секреция sFas/Apo-1 все еще превышает системную, но вследствие явного ослабления первой по мере прогрессирования процесса эта разница оказывается менее сильной, чем перед возникновением глаукомы.

Важную дополнительную информацию может дать и исследование sFasL, особенно при прогнозировании перехода ранней стадии ПОУГ в развитые стадии (неблагоприятное значение имеет усиление его секреции и тенденция к уравниванию в обеих тест-пробах), а также при оценке риска перехода в терминальную стадию, на которой уровни sFasL заметно снижаются (по сравнению с развитыми стадиями) также в обеих пробах, но при этом в СЖ бывают выше, чем в СК.

Особое внимание в аспекте прогнозирования прогрессирования ПОУГ привлекает соотношение уровней sFas/Apo-1 и sFasL в СЖ. Первый превалировал на всех стадиях заболевания, однако начало клинически явного процесса (I стадия) оказалось сопряжено с максимальной разницей этих показателей (более чем в 30 раз), а дальнейшее прогрессирование — со значительным уменьшением разрыва между ними (до 6—8 раз; р=0,000).

Представленные данные определяют актуальность разработки подходов к целенаправленному устранению прежде всего локального «дефицита» sFas/Apo-1, а также ослаблению экспрессии sFasL.

Изучение возможностей медикаментозного воздействия на изучавшиеся маркеры апоптоза у больных с I—III стадиями ПОУГ показало, что после парентерального курса терапии цитиколином у большинства пациентов значительно (в 1,5 раза и более) изменялось содержание sFasL (76,7%) и sFas/Apo-1 (53,2%) в СК и почти в половине (по 45,6%) случаев в СЖ, что особенно важно исходя из патогенетической значимости «локального» показателя. Наиболее явные, статистически подтвержденные (р=0,016) сдвиги местной секреции проявились повышением уровня sFas/Apo-1 у всех пациентов с исходно сниженным содержанием его в СЖ (<150 пг/мл) и падением уровня sFasL у большинства (75%) больных с высоким фоном (>100 пг/мл; р=0,031), что сочеталось с достоверным уменьшением площади скотом (снижение индекса МD; р=0,002) , подтверждавшим позитивную направленность этих сдвигов и лечебный эффект препарата.

При повышенных исходных уровнях sFas/Apo-1 (в пределах 500—1600 пг/мл) и пониженных sFasL (<100 пг/мл) сдвиги, как правило, были противоположными (снижение уровня sFas/Apo-1 и повышение sFasL), что свидетельствовало об определенном иммунокорригирующем эффекте цитиколина. Однако при этом диапазоне фоновых значений изменения их после курса лечения отмечались вдвое реже (sFas/Apo-1 в 58,8% случаев, sFasL в 50%), а при максимальных исходных уровнях sFas/Apo-1 (>1600 пг/мл) фактически не выявлялись. Влияния терапии на функциональные показатели при этом также не наблюдалось. Следует отметить, что мы не выявили какой-либо связи между исследованными маркерами апоптоза и показателем RNFL на HRT III, отражающего толщину слоя нервных волокон сетчатки, как и заметного изменения последних на фоне лечения. Необходимо подчеркнуть, что оценка терапевтической эффективности цитиколина у больных с разными стадиями ПОУГ вне связи с маркерами апоптоза не выявила каких-либо существенных различий в действии препарата.

Таким образом, парентеральное применение цитиколина способствовало оптимизации лечения (уменьшению площади скотом и в меньшей степени улучшению светочувствительности сетчатки без влияния на слой нервных волокон) в основном за счет стимуляции сниженной локальной секреции sFas/Apo-1 и устранения тенденции к усилению sFasL. Ослабить явно повышенную секрецию sFas/Apo-1, выявлявшуюся преимущественно на начальных стадиях заболевания и при подозрении на глаукому, практически не удавалось. Не исключено, что для этого нужны другие схемы приема и дозы цитиколина или другие препараты. Однако целесообразность такой коррекции не очевидна и требует специального изучения в условиях клинико-иммунологического мониторинга.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что возникновение и развитие ПОУГ ассоциируется с нарушением механизма Fas-опосредованного апоптоза, индикатором которого могут служить уровни и соотношение sFas/Apo-1 и sFasL в СЖ и в меньшей степени в СК. Выявлены характерные особенности в состоянии системы Fas/FasL, связанные со стадией глаукоматозного процесса и коррелирующие с некоторыми клинико-функциональными (периметрическими) показателями, что важно как для понимания патогенеза ПОУГ и глаукоматозной оптической нейропатии, так и для прогнозирования течения заболевания. Показано, что применение нейротропного препарата цитиколина сопровождается иммунокорригирующим и терапевтическим эффектами, способствуя оптимизации изучавшихся иммунологических и периметрических параметров (улучшение светочувствительности сетчатки, уменьшение площади скотом). Воздействие цитиколина (или отсутствие такового) зависело от фоновых значений маркеров апоптоза и не затрагивало состояние нервных волокон сетчатки (по показателям HRT).

1. Получены данные, свидетельствующие о вкладе Fas-опосредованного апоптоза в патогенез ПОУГ и о прогностической информативности исследования его маркеров (sFas/Apo-1 и sFasL), включая абсолютные уровни и соотношение их между собой в СЖ, а также баланс с содержанием в СК.

2. Признаками риска возникновения ПОУГ могут служить местная «гиперсекреция» sFas/Apo-1 (по сравнению с системной) и явное превалирование его над sFasL в СЖ. Прогностически неблагоприятными признаками развития заболевания являются усиление локальной и системной секреции sFasL и сглаживание разрыва между содержанием sFas/Apo-1 в СЖ и СК.

3. При клинико-иммунологическом мониторинге основными критериями перехода в терминальную стадию могут служить явное ослабление местной секреции sFas/Apo-1 (СЖ) и фактическое отсутствие разницы с системной его секрецией (СК).

4. Применение цитиколина (парентерально) оказывает оптимизирующее влияние на изучавшиеся маркеры апоптотического процесса и клинико-функциональные (периметрические) параметры у больных с I—III стадиями ПОУГ. Воздействие препарата проявляется в зависимости от фоновых показателей апоптоза (иммунокорригирующий эффект) и бывает наиболее выраженным у пациентов с исходно низким содержанием в СЖ sFas/Apo-1 и повышенным sFasL, сочетаясь с терапевтическим эффектом.