KIM-1 — молекула повреждения почки 1-го типа

MCP-1 — моноцитарный хемотаксический фактор 1-го типа

ААВ — ассоциированные с АНЦА васкулиты

АНЦА — антинейтрофильные цитоплазматические антитела

АНЦА-ГН — гломерулонефрит, ассоциированный с АНЦА

ГН — гломерулонефрит

рСКФ — расчетная скорость клубочковой фильтрации

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

СПУ — суточная протеинурия

СРБ — С-реактивный белок

Поражение почек входит в спектр клинически наиболее значимых проявлений ассоциированных с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (АНЦА) васкулитов (ААВ), частота его развития при различных нозологических формах заболевания составляет от 20 до 95% [1, 2]. ААВ остаются наиболее частой причиной развития быстропрогрессирующего гломерулонефрита (ГН) во взрослой популяции [3]. При этом терминальная стадия почечной недостаточности развивается более чем у 20% пациентов, несмотря на адекватную иммуносупрессивную терапию [4, 5]. Кроме того, поражение почек значительно ухудшает общую выживаемость больных ААВ [6].

В настоящее время биопсия почки является «золотым стандартом» диагностики активного ГН, ассоциированного с АНЦА (АНЦА-ГН), однако эта инвазивная процедура сопряжена с определенными рисками; кроме того, в повседневной клинической практике выполнение повторных биопсий не всегда возможно. Между тем по клиническим критериям четко установить активность заболевания, как и оценить эффективность проводимой терапии, часто невозможно. Так, протеинурия и гематурия могут персистировать после достижения ремиссии и не всегда позволяют отличить активность АНЦА-ГН от проявлений необратимого повреждения почек [7]. В то же время повышение уровня креатинина в крови нередко отмечается уже на этапе необратимой утраты функции почек [8]. Титр АНЦА может не коррелировать с активностью заболевания: у небольшого числа пациентов с поражением почек при ААВ не удается выявить АНЦА, в то же время они встречаются при других заболеваниях [9].

В связи с ключевым значением ранней диагностики и своевременного начала лечения для «почечной» выживаемости целесообразным остается поиск новых методов неинвазивной диагностики и оценки активности ААВ. За последние 25 лет в качестве потенциальных диагностических инструментов для оценки активности ААВ в целом и АНЦА-ГН в частности предложено более 160 сывороточных и мочевых маркеров [10]. Для нашего исследования мы выбрали 3 перспективных молекулы-кандидата: моноцитарный хемотаксический фактор 1-го типа (MCP-1), молекулу повреждения почки 1-го типа (KIM-1) и коллаген IV типа.

Основной функцией хемокина MCP-1 является привлечение лейкоцитов в очаг воспаления [11]. Повышение экспрессии MCP-1 выявляют как в экспериментальных моделях ГН, так и у пациентов с воспалительным поражением клубочков [12]. Отечественными авторами продемонстрированы повышение экскреции с мочой MCP-1 у пациентов с хроническим ГН, а также корреляция уровня MCP-1 в моче с выраженностью воспалительной клеточной инфильтрации интерстициальной ткани и величиной тубулоинтерстициального фиброза в нефробиоптате [13]. В небольших исследованиях показаны повышение экспрессии MCP-1 в различных структурах почки больных АНЦА-ГН, а также корреляция между уровнем мочевой экскреции MCP-1 и активностью заболевания, однако данные о диагностической ценности теста остаются противоречивыми [14, 15].

KIM-1 рассматривают преимущественно как маркер острого повреждения почек (некроза канальцев), однако после того, как в эксперименте была доказана возможность экспрессии KIM-1 в клубочках, а повышенную экскрецию KIM-1 с мочой стали фиксировать у пациентов с различными заболеваниями почек, включая диабетическую нефропатию, фокально-сегментарный гломерулосклероз, мембранозную нефропатию и системную красную волчанку, этот маркер стали рассматривать и как свидетельство хронического повреждения почек [16—18]. В единственном исследовании отмечено повышение уровня KIM-1 в моче у пациентов с активным АНЦА-ГН по сравнению с активным васкулитом без поражения почек и ремиссией, однако диагностическая ценность теста оценивалась как умеренная [15].

Коллаген IV типа — один из основных компонентов базальной мембраны клубочка, а его концентрация в моче отражает интенсивность локально-почечного синтеза и деградации внеклеточного вещества [19, 20]. Экскреция коллагена IV типа с мочой обладает высокой чувствительностью для диагностики гипертонической и диабетической нефропатии уже на раннем этапе поражения почек [21, 22]. По данным российских авторов, у пациентов с хроническим ГН уровень мочевой экскреции коллагена IV типа коррелировал с уровнем протеинурии и снижением скорости клубочковой фильтрации [23]. В исследовании Y. Furumatsu и соавт. [24] повышение концентрации коллагена IV типа в моче выявлено у 26 пациентов с морфологически подтвержденным АНЦА-ГН. В настоящее время это единственная работа, посвященная изучению концентрации коллагена IV типа у пациентов с АНЦА-ГН.

Цель исследования — изучить в сыворотке крови и моче больных концентрацию ААВ MCH-1, KIM-1 и коллагена IV типа и определить их значение в оценке активности АНЦА-ГН.

В исследование включили 78 пациентов с ААВ, среди них 48 с гранулематозом с полиангиитом (ГПА), 19 с микроскопическим полиангиитом (МПА) и 11 с эозинофильным гранулематозом с полиангиитом (ЭГПА). Диагноз во всех случаях соответствовал критериям Американской коллегии ревматологов и/или классификации, принятой на конференции в Чапел-Хилле в 2012 г. Демографические характеристики выборки представлены в табл. 1.

Пациентов разделили на 3 группы в зависимости от активности заболевания, оцененной на основании величины BVAS и BVAS renal. В 1-ю группу вошли пациенты с активным васкулитом и поражением почек — медиана BVAS 18 (12; 21) баллов, BVAS renal 10 (6; 12) баллов; во 2-ю группу — пациенты с активным ААВ без признаков активности нефрита на момент обследования — медиана BVAS 6 (4; 8) баллов, BVAS renal 0; в 3-ю группу — пациенты с длительной ремиссией заболевания (BVAS 0 и BVAS renal 0). Продолжительность заболевания статистически значимо меньше в группе активного АНЦА-ГН (1-я группа). На момент обследования 96% пациентов получали иммуносупрессивную терапию.

Для диагностики и оценки тяжести поражения почек определяли уровень креатинина в сыворотке крови и расчетную скорость клубочковой фильтрации (рСКФ) по формуле CKD-EPI, показатели гематурии и суточной протеинурии.

Методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию MCP-1 в сыворотке крови и моче 76 больных ААВ («Bender MedSystems GmbH», Австрия), концентрацию KIM-1 в моче 78 больных ААВ («Cloud-Clone Corp. USCN Life Science Inc.», США, КНР), концентрацию коллагена IV типа в сыворотке крови и моче 78 больных ААВ («EKF Diagnostics Ltd.», Ирландия).

Статистический анализ проводили с использованием статистической программы Statistica (StatSoft) версии 7.0. Нормальность распределения тестировали при помощи критерия Ша-пиро—Уилка. Данные для количественных показателей с нормальным распределением представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М±m), для количественных показателей с распределением, отличавшимся от нормального, — в виде медианы и межквартильного размаха (25-й процентиль; 75-й процентиль). Данные для показателей с номинальным (качественным) типом шкалы представлены в виде абсолютных частот и доли в группе в процентах. Оценку значимости различий в группах для количественных переменных проводили при помощи критерия t Стьюдента (в отсутствие статистически значимых отклонений от нормального распределения) или критерия Манна—Уитни (при отклонении распределения от нормального), для переменных с номинальным типом распределения — при помощи точного критерия Фишера. Для оценки независимого влияния факторов риска на исходы использовали множественную логистическую регрессию. Оценку качества бинарной классификации проводили с помощью ROC-анализа. В качестве пороговых выбраны значения концентрации биомаркеров, для которых значение индекса Юдена (чувствительность + специфичность – 1) было наибольшим. Статистически значимыми считали различия при p<0,05, для коррекции при множественном попарном сравнении использовали поправку Бонферрони.

Зависимость концентрации MCP-1, KIM-1 и коллагена IV типа от пола, возраста, нозологической формы ААВ и типа АНЦА. При сравнении концентрации биомаркеров у мужчин и женщин статистически значимые различия выявлены только по уровню мочевой экскреции коллагена IV типа, которая оказалась статистически значимо выше у мужчин (p=0,0023). Не выявлено статистически значимых корреляций между возрастом пациентов и концентрацией биомаркеров (для всех сравнений p>0,05). За исключением мочевой экскреции MCP-1, которая была статистически значимо выше у пациентов с МПА, чем в группе ГПА (p=0,0167), концентрации маркеров в сыворотке и моче у пациентов с ГПА, МПА и ЭГПА статистически значимо не отличались (p>0,05). Уровни всех биомаркеров в группах носителей антител к протеиназе-3 (n=38) и миелопероксидазе (n=25) сопоставимы (для всех сравнений p>0,05).

Зависимость концентрации биомаркеров от активности заболевания. Уровень экскреции с мочой MCP-1 и коллагена IV типа у пациентов с активным АНЦА-ГН (1-я группа) был статистически значимо выше, чем у пациентов с ремиссией ААВ (3-я группа), но также и пациентов с активным васкулитом без поражения почек (2-я группа). При этом уровень изученных биомаркеров в сыворотке крови сопоставим во всех 3 группах (табл. 2).

Уровень экскреции KIM-1 с мочой также статистически значимо выше у пациентов с активным АНЦА-ГН (1- я группа), чем у пациентов с активным васкулитом без поражения почек (2-я группа), в то же время статистически значимых различий с пациентами в ремиссии (3-я группа) не отмечено из-за большой вариабельности показателя (см. табл. 2).

Взаимосвязи уровней исследуемых биомаркеров с традиционными показателями активности заболевания. Нами выявлены статистически значимые прямые корреляции между уровнями всех мочевых маркеров, при этом наиболее сильная связь между мочевой экскрецией KIM-1 и MCP-1 (r_s=0,66; p<0,0001). Корреляция между уровнем MCP-1 в моче и сыворотке была статистически значимой, однако крайне слабой (r_s=0,26; p=0,024). Корреляция между уровнями коллагена IV типа в сыворотке и моче была средней силы (r_s=0,43; p=0,0001). Ни один из маркеров не имел связи с возрастом пациентов, однако все они, за исключением концентрации MCP-1 в сыворотке, имели обратную связь с длительностью заболевания (табл. 3).

Статистически значимые корреляции средней силы выявлены между концентрацией в моче MCP-1, KIM-1, коллагена IV типа и традиционными индикаторами активности АНЦА-ГН индексом BVAS renal, величиной суточной протеинурии, гематурии, а также показателями, отражающими состояние функции почек, — уровнем креатинина в сыворотке крови и рСКФ (см. табл. 3). При этом уровень MCP-1 в моче имел наиболее сильную прямую корреляцию с традиционными маркерами активности ГН, а уровень коллагена IV типа в моче — наиболее сильную обратную связь с показателями функции почек.

В отличие от концентрации MCP-1 в моче концентрация MCP-1 в сыворотке крови имела лишь слабые прямые корреляции с показателями, отражающими активность АНЦА-ГН и функцию почек (см. табл. 3). При этом уровень MCP-1 в сыворотке крови был единственным маркером, статистически значимо связанным с концентрацией СРБ.

Концентрация коллагена IV типа в сыворотке крови, как уровень и его экскреции с мочой, имела статистически значимые корреляции с традиционными маркерами активности ГН, однако сила корреляции была ниже (см. табл. 3).

Определение диагностической ценности изучаемых мочевых биомаркеров для выявления активного АНЦА-ГН. Для определения диагностической ценности изучаемых маркеров выполняли анализ построенных ROC-кривых (см. рисунок). Показатель площади под кривой был наибольшим для мочевой экскреции MCP-1 и несколько ниже для мочевой экскреции KIM-1 и коллагена IV типа.

Наиболее чувствительным (92%) индикатором активного АНЦА-ГН являлся уровень экскреции с мочой MCP-1 >159 пг/мл, однако его специфичность была недостаточно высокой (66,7%) (табл. 4). Наибольшей специфичностью (84,9%) в отношении активного АНЦА-ГН обладал уровень экскреции коллагена IV типа с мочой >3,09 мкг/л, однако чувствительность этого теста не превышала 60% (см. табл. 4). Мочевой показатель KIM-1 >2674,5 пг/мл занимал промежуточное положение по чувствительности (84%) и специфичности (66%). Следует отметить, что все три теста обладали высокой прогностической значимостью отрицательного результата (вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста), среди них наибольшей обладала концентрация MCP-1 в моче (ввиду высокой чувствительности). При этом прогностическая значимость положительного результата (вероятность наличия заболевания при положительном результате теста) была ниже (см. табл. 4).

По данным регрессионного анализа достоверными индикаторами наличия у пациента активного нефрита в исследованной группе был уровень экскреции с мочой MCP-1 и коллагена IV типа в совокупности с величиной суточной протеинурии и СОЭ. Для определения ценности этого нового интегрального показателя для диагностики активного АНЦА-ГН нами выполнен анализ построенной ROC-кривой новой переменной, рассчитанной по формуле: (–0,017 + 0,417 · СПУ + 0,009 · СОЭ + 0,0002 · uMCP + 0,02 · коллаген), где СПУ — суточная протеинурия.

При выбранном пороговом значении >0,2768 предложенная нами модель обладала большей, чем у отдельных мочевых маркеров, чувствительностью (96%) и специфичностью (84,9%). Прогностическая значимость положительного и отрицательного интегрального показателя также были выше и достигали 75 и 97,8% соответственно (см. табл. 4).

Результаты проведенного нами исследования показали, что концентрация в моче MCP-1, KIM-1 и коллагена IV типа выше у пациентов с активным АНЦА-ГН и практически не зависит от пола и возраста пациентов, а также нозологической формы ААВ. Обратную связь концентрации маркеров в моче с длительностью заболевания можно объяснить большим числом пациентов с впервые диагностированным ААВ в группе активного АНЦА-ГН.

По нашим данным, как и в работе F. Tam и соавт. [14], экскреция с мочой MCP-1 наиболее высокая в группе пациентов с активным АНЦА-ГН. При этом у отдельных пациентов с активным ААВ без поражения почек и ремиссией заболевания выявлена высокая концентрация маркера, что наблюдалось и в исследовании J. Lieberthal и соавт. [15]. Сравнительно невысокая специфичность MCP-1 может объясняться наличием субклинической активности АНЦА-ГН у отдельных пациентов в группах активного ААВ без поражения почек и неактивного васкулита (ремиссии). Слабая корреляция между уровнями MCP-1 в моче и сыворотке крови (r_s=0,26; p=0,024) подтверждает определяющее влияние на величину мочевого показателя MCP-1 локально-почечного иммунного воспаления, но не фильтрации из системного кровотока. При этом уровень MCP-1 в сыворотке крови не зависел от активности АНЦА-ГН и имел лишь слабую связь с активностью системного воспаления. Статистически значимо более высокий уровень экскреции MCP-1 у больных МПА, с нашей точки зрения, обусловлен преобладанием этой нозологической формы в группе пациентов с активным АНЦА-ГН.

Экскреция KIM-1 с мочой выше в группе пациентов с активным АНЦА-ГН, однако тест обладал низкой специфичностью, в связи с чем высокие его значения выявлены и у ряда пациентов в ремиссии заболевания. Интерпретацию результатов исследования KIM-1 затрудняет возможность повышения его титра не только при активном АНЦА-ГН (повреждения клубочкового аппарата), так и при развитии острого повреждение почек (тубулярный некроз), в том числе под воздействием нефротоксичных препаратов (повышенная экскреция выявлялась нами у пациентов через день после введения циклофосфамида). Сходные выводы сделаны и зарубежными исследователями [15].

Экскреция коллагена IV типа с мочой оказалась наименее чувствительным, но наиболее специфичным маркером активного АНЦА-ГН. При этом, несмотря на наличие прямой корреляции между уровнями маркера в сыворотке крови и моче, концентрация коллагена IV типа в сыворотке сопоставима во всех группах. Повышенный уровень экскреции коллагена IV типа с мочой у пациентов с АНЦА-ГН также выявлен в работе японских авторов, однако в исследовании не проведен анализ его чувствительности, специфичности и взаимосвязи с другими показателями активности заболевания [24]. Вопрос о значении концентрации коллагена IV типа в сыворотке крови остается открытым. Выявленная корреляция между уровнями биомаркера в сыворотке и моче по всей видимости обусловлена активностью васкулита, приводящей к одновременному повреждению как почечных, так и внепочечных сосудов с усилением процессов деградации коллагеновых структур сосудистой стенки.

В пользу преимущественно локально-почечного воспалительного происхождения изученных маркеров свидетельствуют выявленные нами корреляции между уровнем экскреции с мочой MCP-1, KIM-1 и традиционными маркерами активного нефрита — величиной протеинурии, гематурии, индексом BVAS renal. Концентрация коллагена IV типа также коррелировала с выраженностью протеинурии, гематурии и индексом BVAS renal, однако наиболее сильная связь отмечена с уровнем креатинина в сыворотке крови (и рСКФ). Поскольку гиперкреатининемия и снижение СКФ могут отражать не только активность ГН, но и формирование фиброзных изменений в почке, то связь повышения экскреции коллагена IV типа в моче с этими клиническими показателями может быть маркером активации фиброгенеза в почке и отражать более поздний этап поражения почек при АНЦА-ГН, что особенно важно в отсутствие возможности морфологического подтверждения на основе биопсийного материала [20].

Однако, как и результаты предшествующих исследований, наши данные свидетельствуют о недостаточной чувствительности и/или специфичности каждого из этих показателей для диагностики активного АНЦА-ГН. В связи с этим нами предпринята попытка их комбинированного определения наряду с традиционными маркерами активности заболевания. Выявленные методом множественной регрессии прогностически значимые признаки (СПУ, СОЭ, уровень MCP-1 и коллагена IV типа) объединены в интегральный показатель, который по своей чувствительности и специфичности существенно превосходил каждый биомаркер в отдельности.

Идея создания высокоинформативной интегральной модели, включающей определение нескольких неинвазивных маркеров, для оценки активности ААВ представляется перспективной и другим авторам. В частности, А. Kronbichler и соавт. [10] предложили использовать набор, включающую определение концентрации MCP-1 в моче и СРБ, для диагностики активного АНЦА-ГН. Однако в нашем исследовании концентрация СРБ не являлась статистически значимым показателем активности заболевания, что, вероятно, обусловлено быстрым снижением уровня СРБ в результате лечения (большинство пациентов получали иммуносупрессивную терапию на момент обследования).

Несмотря на ряд ограничений, в числе которых малый размер выборки и однократное определение концентрации биомаркеров в моче больных, в отсутствии данных о характере морфологических изменений в ткани почки, предложенная нами модель с использованием мочевых биомаркеров, в первую очередь MCP-1 и коллаген IV типа, представляется перспективным методом неинвазивной диагностики и оценки активности АНЦА-ГН. Для более точного определения их места в клинической практике требуются более крупные исследования в динамике с выполнением нефробиопсии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.