Роль маркеров ремоделирования сосудов в формировании остеопороза при идиопатической легочной артериальной гипертонии

ДЗЛА - давление заклинивания легочной артерии

ИЛАГ - идиопатическая легочная артериальная гипертония

ИМТ - индекс массы тела

ЛАГ - легочная артериальная гипертония

МКВ - межклеточное вещество

МПКТ - минеральная плотность костной ткани

ОЛСС - общее легочное сосудистое сопротивление

ОП - остеопороз

ОС - остеопенический синдром

СДЛА - среднее давление в легочной артерии

СИ - сердечный индекс

ТШХ - тест с 6-минутной ходьбой

ФК - функциональный класс

ЭТ-1- эндотелин-1

CITP - C-концевой телопептид коллагена I типа

FN - недоминантная шейка левой бедренной кости

LS - поясничный отдел позвоночника

MMP-9 - металлопротеиназа-9

MMPs - матриксные металлопротеиназы

SD - стандартное отклонение

TIMP - тканевый ингибитор металлопротеиназы

Остеопороз (ОП) относится к системным проявлениям хронической патологии легких и сердца [1]. Снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) активно обсуждается в современных проектах GOLD-2016 и GINA-2015 [2, 3], посвященных проблемам хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астмы [4-7]. В связи с увеличением продолжительности жизни, а также вследствие расширения лечебных и диагностических возможностей растет внимание и к другим системным проявлениям заболеваний кардиореспираторной системы, в частности в популяции отмечается четкая тенденция к росту частоты регистрации случаев легочной артериальной гипертонии (ЛАГ), в качестве как идиопатического поражения сосудов малого круга кровообращения, так и связанной с другими состояниями и заболеваниями. Идиопатическая ЛАГ (ИЛАГ), относящаяся по своему патогенезу к прекапиллярной легочной гипертонии, по распространенности от 2 (Российская Федерация) до 5,9 случая на 1 млн населения в странах Европы входит в группу редких заболеваний [8, 9]. Несмотря на появление в последние годы целой серии специфических для ЛАГ препаратов, способных в том числе отсрочить трансплантацию легких, обозначенный подход рассматривается как один из наиболее эффективных в увеличении продолжительности жизни пациентов с ИЛАГ. Сложность патогенеза ИЛАГ затрагивает в том числе раннюю потерю костной массы, что значительно затрудняет ведение пациентов в послеоперационном периоде, принимая во внимание использование препаратов, непосредственно влияющих на снижение МПКТ. Соответственно изучение аспектов патогенеза ОП при ИЛАГ относится к актуальной проблеме, требующей решения с различных сторон, в том числе исходя из требований современного этапа с выяснением роли молекулярных механизмов воспаления как одного из доказанных компонентов в потере МПКТ. В зоне дискуссии, в частности, находится роль системы цитокинов, факторов роста, транскрипционных факторов, регуляторных белков и ферментов. Несмотря на прогресс в изучении патофизиологических аспектов остеопенического синдрома (ОС) у больных с различной сердечно-легочной патологией, в литературе имеются только фрагментарные данные, свидетельствующие о состоянии метаболизма костной ткани у больных ИЛАГ [10, 11]. До настоящего времени точно не установлены процессы, играющие пусковую роль в развитии патологических изменений в легочных сосудах при ИЛАГ. Современные теории патогенеза ИЛАГ фокусируются на повреждении эндотелия, приводящего к ремоделированию легочных сосудов, которое охватывает все слои сосудистой стенки и характеризуется пролиферативными и обструктивными изменениями с участием клеток нескольких типов, включая эндотелиальные, гладкие мышечные клетки и фибробласты. Кроме того, в адвентиции повышается продукция межклеточного вещества (МКВ) [12]. Некоторые исследования продемонстрировали важную роль процессов деградации коллагена и ремоделированного МКВ не только в патофизиологии, но и в прогрессировании ИЛАГ [13]. В свою очередь показано, что нарушения синтеза протеинов костной ткани, включая коллаген и эластин, а также функции эндотелия одновременно приводят к структурным изменениям кости при различных заболеваниях [14-18]. В этой связи ремоделирование сосудов с устойчивыми изменениями МКВ может рассматриваться как один из патогенетических путей не только прогрессирования ИЛАГ, но и потери костной массы. Появляется все больше доказательств тесного взаимодействия между эндотелиальными клетками сосудов и костными клетками [14, 18, 19]. Однако нет опубликованных данных о наличии возможных взаимосвязей маркеров ремоделирования МКВ и сосудов с прогрессирующей потерей МПКТ при ИЛАГ.

Цель настоящего исследования: 1) оценить состояние костного статуса у пациентов с ИЛАГ высокого риска; 2) изучить содержание некоторых циркулирующих биомаркеров метаболизма коллагена, ремоделирования МКВ и сосудов в сыворотке крови и определить их роль в формировании ОС при данной патологии.

В исследование включили 27 пациентов с ИЛАГ высокого риска, находящихся на обследовании в отделениях пульмонологии университетской больницы г. Страсбург (Service de Pneumologie des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg) и Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Приморская краевая клиническая больница № 1» (ГБУЗ ПККБ № 1) Владивостока. Контрольную группу составили 30 практически здоровых некурящих добровольцев, сопоставимых по возрасту и полу. Этическое одобрение проводимого исследования получено независимым этическим комитетом университетской больницы г. Страсбурга (Франция) и независимым междисциплинарным комитетом по этике ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России. Все участники исследования подписали информированное добровольное согласие для участия в данном исследовании.

Критерии включения: наличие ИЛАГ II-IV функционального класса (ФК) согласно принятым критериям, а также получение информированного согласия пациента на участие в исследовании. Критерии исключения: другие формы ЛАГ; сахарный диабет; онкологические заболевания; тяжелая почечная или печеночная недостаточность.

Диагноз ИЛАГ устанавливали согласно рекомендациям диагностики и лечения ЛАГ Европейского общества кардиологов и Европейского респираторного общества (2015 г.) [9]. Для характеристики ФК использовали Рекомендации NYHA и ВОЗ (1998 г.). Для постановки диагноза ИЛАГ использовали методы неинвазивной и инвазивной диагностики. Неинвазивную оценку гемодинамики проводили при помощи допплероэхокардиографии (Echocardiography standard-m, 2D, color-Doppler). Катетеризацию правых отделов сердца выполняли для точной оценки центральной гемодинамики. Метод непосредственной регистрации кривых среднего давления в легочной артерии (CДЛА), давления в правом предсердии и правом желудочке, давления заклинивания легочной артерии (ДЗЛА) осуществлялся при помощи плавающих баллонных поливинилхлоридных катетеров Свана-Ганца («Edwards», США) на аппарате Philips Allure FD 10 с пакетным обеспечением Haemo Sphere. С помощью пакета программ автоматически вычисляли сердечный выброс по методу Фика, сердечный индекс (СИ) и ударный объем. Общее легочное сосудистое сопротивление (ОЛСС) рассчитывали по формулам: СДЛА/МОС и СДЛА/МОС·80 дин·с·см^–5, где МОС - минутный объем сердца.

Всем пациентам проводили тест с 6-минутной ходьбой (ТШХ) и определением индекса одышки по Боргу. Спирография и бодиплетизмография с определением функциональных параметров легких и диффузионной способности легких по монооксиду углерода (DL_CO) выполнялись на спирографе Master Screen PFT Jaeger GmbH (Вюрцбург, Германия). Газометрия артериальной крови проводилась с помощью аппарата ABL 725 radiometer (Дания).

МПКТ в поясничном отделе позвоночника (LS) и недоминантной шейке левой бедренной кости (FN) оценивали с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорциометрии (DEXA, Hologic, USA). Результаты исследования оценивали в стандартных отклонениях - SD (T-критерий). Дефиниции О.С. проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ: Т-критерий (число SD от пиковой костной массы) в диапазоне –1 до –2,5 SD расценивали как остеопению; при Т-критерии ниже – 2,5 SD - О.П. Норма соответствовала Т-критерию больше –1 SD.

Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывали по формуле: ИМТ = масса тела (кг)/рост (м)².

Уровень показателя метаболизма C-концевого телопептида коллагена I типа (CITP) в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA, CITP EIA). Уровни маркеров МКВ - металлопротеиназы-9 (MMP-9), ее тканевого ингибитора (TIMP-1) и комплекса ММР-9/ТIМР-1 в сыворотке крови определяли методом сандвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с применением специфических реактивов («R&D Diagnostics Inc.», США). Концентрацию эндотелина-1 (ЭТ-1) исследовали в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с помощью стандартного коммерческого набора (ELISA, «Quantikine, R&D Systems, Inc.»).

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 10. Применяли метод вариационной статистики с вычислением средних величин (М), ошибки средней величины (m). Достоверность различий определяли с помощью критерия Стьюдента. Для выявления связи между отдельными показателями применяли метод корреляционного анализа, при котором прямую или обратную связь оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона. Статистически достоверными считали различия при р≤0,05.

Клинические и биохимические параметры пациентов с ИЛАГ и группы контроля представлены в таблице. Возраст и ИМТ не различались между группами. МПКТ была достоверно ниже как в FN, так и в LS (см. таблицу). ОП диагностирован у 15 (36%) пациентов в FN и у 14 (52%) в LS. Остеопения выявлена у 9 (33%) больных в FN и у 10 (37%) в LS. В контрольной группе у 4 (13%) добровольцев зарегистрирована остеопения, у остальных МПКТ находилась в пределах нормы. Уровни CITP, MMP-9, TIMP-1 и ЭТ-1 в сыворотке крови пациентов с ИЛАГ высокого риска были выше, чем у здоровых добровольцев. Отмечена тенденция к повышению содержания комплекса ММР-9/ТIМР-1 в сыворотке крови (см. таблицу).

Не найдено корреляций между возрастом, полом и МПКТ в исследуемых зонах в группе c ИЛАГ. Корреляционный анализ между функционально-гемодинамическими параметрами и показателями плотности кости показал наличие взаимосвязи и ТШХ с МПКТ в FN (r=0,605; p=0,0008) и LS (r=0,417; p=0,030). Среди гемодинамических показателей только ОЛСС ассоциировано с МПКТ как в FN (r=–0,522; p=0,005), так и LS (r=–0,494; p=0,008). Мы не обнаружили ассоциации между концентрацией СITP, MMP-9 и комплекса MMP-9/TIMP-1 в сыворотке крови и гемодинамическими параметрами. Уровень TIMP-1 в сыворотке крови коррелировал с СИ (r=–0,422; p=0,028) и ОЛСС (r=0,385; p=0,047).

Корреляционный анализ выявил обратные связи между МПКТ и циркулирующими MMP-9, TIMP-1 и комплекса MMP-9/TIMP-1. Обратная корреляция между концентрацией циркулирующим СITP и МПКТ выявлена только в FN (r=0,684; р=0,0001). Состояние вазоконстрикторного резерва у пациентов с ИЛАГ, оцененное по содержанию ЭТ-1 в сыворотке крови, характеризовалось значительным повышением относительно группы контроля (см. таблицу). Концентрация ЭТ-1 связана с СДЛА (r=0,462; p=0,015), СИ (r=−0,552; p=0,003) и ОЛСС (r=0,856; p<0,0001). Установлена обратная корреляция между содержанием ЭТ-1 и МПКТ в FN (r=–0,485; р=0,010). Таким образом, совершенно ожидаемое повышение вазоконстрикторного резерва у пациентов с ИЛАГ оказалось связанным с ухудшением параметров внутрисердечной гемодинамики и сопряжено со снижением МПКТ.

Корреляционный анализ показал наличие прямой связи между повышенными уровнями MMP-9, TIMP-1 и CITP в сыворотке крови. При этом наблюдалась только тенденция к положительной корреляции между концентрацией CITP и уровнем ЭТ-1 в сыворотке крови (r=0,373; р=0,056).

Итак, результаты нашего исследования еще раз подтверждают ведущую роль дизрегуляции эндотелиновой системы в развитии стойких гемодинамических нарушений при ИЛАГ высокого риска и свидетельствуют об ее участии в развитии О.С. При этом повышенная секреция ЭТ-1 инициирует потерю костной ткани, возможно, через активацию распада соединительнотканного матрикса (базальная мембрана сосудов), о чем свидетельствуют изученные нами маркеры, в частности CITP, MMP-9 и TIMP-1.

Существуют убедительные данные, что прогрессирование тяжелых сердечно-легочных заболеваний сопровождается изменением метаболизма костной ткани. Ввиду того что ИЛАГ соответствует критериям редких заболеваний, исследования, направленные на изучение состояния костного статуса при данной патологии, единичны. Согласно данным О. Tschopp и соавт. [10], почти у 60% пациентов с ИЛАГ, ожидающих пересадку легких, имелся О.С. Аналогичные результаты представлены N. Malik и соавт. [11]. В нашем исследовании у более 50% обследованных пациентов с ИЛАГ МПКТ соответствовала ОП.

Костный гомеостаз регулируется сложным комплексом внешних определяющих, гормональных, молекулярных и генетических факторов, которые тесно связаны между собой.

Одним из механизмов формирования ОС считается снижение уровня физической активности. ТШХ, широко используемый в диагностике ИЛАГ, а также для оценки эффективности терапии и прогноза выживаемости, определяет также толерантность к физическим нагрузкам. В нашем исследовании показана ассоциация между тестом ТШХ и снижением МПКТ в FN у больных ИЛАГ. Аналогичные результаты продемонстрированы ранее [10, 11]. Среди гемодинамических параметров только ОЛСС обратно коррелировал с МПКТ в FN. Вероятно, толерантность к физическим нагрузкам является более стабильным, чем гемодинамические нарушения, индикаторами снижения МПКТ при ИЛАГ.

В настоящее время активно обсуждается роль дисфункции эндотелия в процессах остеогенеза. Развитие ИЛАГ, относящейся по патогенезу к группе прекапиллярной ЛАГ, напрямую сопряжено с развитием структурных изменений сосудистого русла. В свою очередь при повреждении эндотелиального слоя выделяются факторы роста, индуцирующие миграцию к интиме и пролиферацию сосудистых гладких мышечных клеток, отличающихся своей способностью активно синтезировать коллаген, преимущественно I и III типов. В эксперименте установлена выраженная экспрессия мРНК белков цепи α1 коллагена I и IV типов в интерстициальной ткани легких и адвентиции мелких кровеносных сосудов у крыс с моделированной легочной гипертонией [20]. В свою очередь избыточное поступление продуктов распада коллагена в кровь может вызывать периферические гемоваскулярные нарушения с высвобождением системных медиаторов, включая матриксные металлопротеиназы (MMPs), тканевые и сосудистые факторы роста. Z. Safdar и соавт. [13] продемонстрировали, что повышение уровня циркулирующих пропептидов коллагена I и III типов тесно связано с тяжестью и худшим прогнозом ИЛАГ. Ускорение ремоделирования с усилением резорбции кости сопряжено с деградацией коллагенового матрикса и гиперпродукцией коллагена, преимущественно I типа. Согласно результатам нашего исследования повышенный уровень СITP в сыворотке крови сопровождался снижением МПКТ в FN. Вероятно, избыток поступления фрагментов коллагена I типа в кровь при ИЛАГ дополнительно можно объяснить и усиленным распадом коллагенового матрикса кости в результате высокой резорбции костной ткани.

Важным аспектом в патофизиологии ИЛАГ считается дисфункция МКВ. Протеолитическими ферментами МКВ являются MMPs, которые не только участвуют в разрушении коллагена, но и выполняют важные функции в формировании и обмене параваскулярного МКВ, миграции клеток и регулировании роста [21-24]. Показана способность MMPs и их тканевых ингибиторов регулировать осаждение белков МКВ на ригидных сосудах, что углубляет процессы ремоделирования сосудов [25]. Кроме того, циркуляция различных MMPs в крови может отражать состояние белкового обмена в костной ткани. Точная роль ММP-9 в костном гомеостазе неизвестна. Однако установлено, что ее отсутствие у инактивированных ММP-9 мышей приводит к нарушению роста костей у экспериментальных животных [26]. В свою очередь ММP-9 не только секретируется остеокластами и их предшественниками, но и способствует дифференцировке и активации остеокластов, что приводит к усилению резорбции кости [27]. Нарушение равновесия между активностью ММP-9 и ее тканевого ингибитора может оказывать глубокое воздействие на состав паравазального МКВ и влиять на различные функции сосудистых и костных клеток, включая адгезию, миграцию и дифференциацию [28]. В нашем исследовании пациенты с ИЛАГ высокого риска имели достоверно повышенный уровень MMP-9 и TIMP-1 в сыворотке крови по сравнению с группой здоровых, что согласуется с другими исследованиями [22, 29]. При этом выявлена связь между гиперпродукцией ММP-9, TIMP-1, маркера деградации коллагена, и снижением МПКТ. Кроме того, выявлена связь между гиперпродукцией ММP-9, TIMP-1 и повышенным уровнем циркулирующего маркера деградации коллагена CITP, и снижением МПКТ.

ЭТ-1 активно участвует в ремоделирование сосудов при ЛАГ [30]. Более того, в экспериментальных и клинических работах обсуждается вклад дисфункции сосудов в формирование О.С. На примере взаимосвязи жесткости артерий и МПКТ продемонстрирована роль эндотелия в поддержании гомеостаза костной ткани [15-18, 31, 32]. В группе пациентов с ИЛАГ, ожидающих пересадку легких, показатели ригидности легочных сосудов коррелировали с МПКТ [11]. Следовательно, утрата вазодилатационной функции эндотелия может служить фактором ремоделирования как сосудов, так и кости. В то же время роль вазоконстрикторного резерва в изменении МПКТ при ИЛАГ недостаточно изучена. В нашем исследовании выявлено отчетливое увеличение уровня ЭТ-1 в сыворотке крови пациентов с ИЛАГ высокого риска и ОП, а также наблюдалась тенденция к положительной корреляции между уровнями CITP и ЭТ-1 в сыворотке крови.

Таким образом, пациенты с ИЛАГ имеют высокий риск развития О.П. Установленные в нашем исследовании корреляции между функциональными и гемодинамическими параметрами и МПКТ позволяют рассматривать ОЛСС и результаты ТШХ в качестве возможных прогностических факторов развития ОП, инициированного ИЛАГ. Однако формирование ОС при ИЛАГ высокого риска является результатом сложного каскада реакций, в которых следует учитывать роль эндотелиальных и гладкомышечных клеток, принимающих активное участие в генезе фиброза сосудистой стенки и нарушениях микроциркуляции. Так, гиперпродукция ЭТ-1 и дисбаланс маркеров паравазального МКВ в сочетании с избытком коллагена вносят совокупный вклад в генерализованные процессы патологического ремоделирования сосудов и кости при ИЛАГ.

Малая выборка пациентов, включенных в наше исследование, обоснована низкой распространенностью ИЛАГ. Соответственно, с одной стороны, выдвинутые нами предположения носят гипотетический характер, но с другой, с учетом сопоставления наших данных с имеющимися в литературе сведениями других авторов нацеливают на необходимость ранней диагностики и профилактики ОС при ИЛАГ.

Выражаем особую благодарность профессорам медицинского факультета Страсбургского Университета Жильберу Массару и Рома Кесслеру за помощь в организации настоящего исследования.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14−33−00009 «Разработка научно-технических основ формирования новых антикоррозионных биоактивных/биорезорбируемых остеогенерирующих покрытий на металлических имплантатах для медицины».

Конфликт интересов отсутствует.