ДН — диабетическая нефропатия

ИМТ — индекс массы тела

ПСМ — препараты сульфонилмочевины

СД-2 — сахарный диабет 2-го типа

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ХБП — хроническая болезнь почек

ЭАМ — экскреция альбумина с мочой

HbA1c — гликированный гемоглобин А1с

ICAM-1, VCAM-1 — молекулы адгезии

IL-6 — интерлейкин-6

M-CSF — макрофагальный колониестимулирующий фактор

MIF — фактор, ингибирующий миграцию макрофагов

MIP-1α — макрофагальный воспалительный протеин 1α

Сахарный диабет 2-го типа (СД-2) — ведущая причина хронической болезни почек (ХБП) в индустриально развитых странах. В последние годы в развитии ХБП при СД активно обсуждается роль хронического воспаления («микровоспаления», или «воспаления низкой интенсивности»), реализуемого с участием мононуклеаров [1, 2]. Показано, что при диабетической нефропатии (ДН) в клубочках и интерстициальной ткани почек увеличивается количество моноцитов/макрофагов. Количество данных клеток увеличивается по мере развития гломерулярного и интерстициального фиброза [3—6]. Накапливается все больше данных о том, что воспалительные реакции c участием макрофагов играют важную роль в прогрессировании ДН [6—9]. Воспалительные медиаторы — молекулы адгезии (ICAM-1, VCAM-1), интерлейкин-6 (IL-6) являются биомаркерами прогрессирования нефропатии у больных СД-2 [10, 11]. Идентификация новых молекул — регуляторов воспаления рассматривается как подход к созданию будущих методов лечения больных с ДН [1].

Известно, что в регуляции миграции и адгезии моноцитов/макрофагов важную роль играют цитокины: макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), макрофагальный воспалительный протеин 1α (MIP-1α) и фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF). У больных с пролиферативными формами гломерулонефрита зафиксировано значительное повышение экспрессии M-CSF и MIF в клубочках и интерстициальной ткани почек, коррелирующее со степенью макрофагальной инфильтрации и снижением фильтрационной функции [12, 13]. Увеличение концентрации MIF в плазме крови обнаружено у больных СД-2 [14—16]. У пациентов с СД-1 описано повышение уровня циркулирующего MIP-1α [17]. Взаимосвязь концентраций M-CSF, MIP-1α и MIF и развития ХБП, уровня гликемии и содержания других воспалительных медиаторов у больных СД не изучена.

Целью работы стало изучение взаимосвязи уровня воспалительных цитокинов (M-CSF, MIP-1α, MIF, IL-6) в сыворотке крови и ХБП у больных СД-2.

Обследовали 64 больных СД-2 (14 мужчин и 50 женщин) в возрасте от 43 до 70 лет (медиана 62 года), с длительностью заболевания (с момента постановки диагноза) от 6 до 36 лет (медиана 13,5 года). Индекс массы тела (ИМТ) варьировал от 21,8 до 50 кг/м² (медиана 32 кг/м²); избыточная масса тела зафиксирована у 12 человек, ожирение — у 44. Базальный инсулин получали 17 человек, комбинированные инсулины — 10, базис-болюсную инсулинотерапию — 37. В дополнение к инсулину 35 больных принимали метформин, 3 — препараты сульфонилмочевины (ПСМ), 10 — комбинацию метформина и ПСМ. Уровень гликированного гемоглобина А1с (HbA1c) находился в пределах от 5,7 до 14,8% (медиана 8,4%).

В исследование не включали больных ХБП IV и V стадии, с первичной патологией почек, инфекцией мочевыводящих путей, аутоиммунными и хроническими воспалительными заболеваниями, острыми инфекционными заболеваниями, перенесенными в течение 3 мес перед исследованием.

В соответствии с Национальными рекомендациями по ХБП (2012) скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитывали по формуле CKD-EPI, у 8 пациентов с ИМТ >40 кг/м² — по клиренсу эндогенного креатинина (проба Реберга—Тареева). СКФ в диапазоне 30—59 мл/мин/1,73 м² зафиксирована у 19 больных (из них у 4 в диапазоне 30—44 мл/мин/1,73 м²), СКФ в пределах 60—89 мл/мин/1,73 м² — у 36, СКФ >90 мл/мин/1,73 м² — у 10. Учитывая небольшое число больных с СКФ >90 мл/мин/1,73 м², а также то, что для лиц старше 65 лет СКФ в диапазоне 60—89 мл/мин/1,73 м² может являться вариантом нормы, пациентов с СКФ >90 мл/мин/1,73 м² анализировали как единую группу.

Концентрацию альбумина и коллагена IV типа определяли в утренней порции мочи с приведением результата к количеству экскретируемого креатинина. Концентрацию альбумина определяли с помощью тест-систем Albumin ELISA («Immundiagnostik», Германия), концентрацию коллагена IV типа — с помощью наборов Urinary Collagen IV EIA («Daiichi Fine Chemical Co. Ltd», Япония). На основании соотношения альбумин/креатинин у 49 обследованных констатировали нормальную экскрецию альбумина с мочой (ЭАМ), у 13 — микроальбуминурию, у 2 — макроальбуминурию.

Исследование содержания цитокинов проводили в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием планшетного ридера BioRad 680 («BioRad», США) и программного обеспечения Zemfira. Для определения M-CSF, MIP-1α, MIF использовали коммерческие наборы фирмы «R&D Systems» (США). Концентрацию IL-6 определяли с помощью наборов ЗАО «Вектор Бест» (Россия). Контрольную группу для лабораторных исследований составили 15 человек — 5 мужчин и 10 женщин в возрасте от 40 до 68 лет без хронических заболеваний и отягощенной по СД наследственности.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом. Все пациенты давали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 10 («StatSoft, Inc», 2011, CША). Учитывая, что распределение большинства изученных признаков отличалось от нормального, применяли методы непараметрической статистики. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия Манна—Уитни и ANOVA Крускала—Уоллиса. Взаимосвязь признаков изучали с помощью рангового корреляционного анализа Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Данные представлены как медиана (25-й процентиль; 75-й процентиль).

Согласно данным, приведенным в табл. 1, пациенты с СКФ в диапазоне 30—59 мл/мин/1,73 м² в среднем были несколько старше и имели большую длительность СД, чем пациенты с СКФ >60 мл/мин/1,73 м². Анализ антропометрических параметров, показателей углеводного и липидного обмена не выявил достоверных различий между группами. Экскреция коллагена IV типа с мочой у больных с СКФ в диапазоне 30—59 мл/мин/1,73 м² оказалась достоверно выше, чем у пациентов с более высокой СКФ (р=0,01).

У пациентов с СКФ >60 мл/мин/1,73 м² концентрация M-CSF (р=0,0003) и MIF (р=0,001) была достоверно повышена по сравнению с таковой в контрольной группе (табл. 2). Концентрации MIP-1α и IL-6 демонстрировали тенденцию к увеличению (р=0,11). У пациентов с СКФ <60 мл/мин/1,73 м² выявлено изменение уровня всех исследованных молекул. Медиана концентрации M-CSF превышала в 2,5 раза значение в контроле (р<0,0001), MIP-1α — в 2,6 раза (р=0,002), MIF и IL-6 — в 1,5 раза (р=0,02). Достоверные различия между группами больных с разной СКФ отмечены для M-CSF (p=0,02) и MIP-1α (р=0,02).

Больные с повышенной ЭАМ по сравнению с пациентами с нормоальбуминурией имели достоверно более высокие уровни M-CSF — 550 (443—755) и 403 (327—500) пг/мл соответственно (р=0,01) и IL-6 — 3,35 (1,88—4,67) и 1,93 (1,39—2,76) пг/мл соответственно (р=0,03); отмечена тенденция к большему уровню MIP-1α — 26,7 (13,6—31,1) и 16,5 (9,2—25,3) пг/мл соответственно (р=0,09). Концентрации M-CSF, MIP-1αa и IL-6 положительно коррелировали с экскрецией альбумина и коллагена IV типа (табл. 3).

Не выявлено достоверных корреляций между содержанием цитокинов и возрастом больных, длительностью СД, уровнем HbA1c и гликемией. По мере увеличения выраженности ожирения возрастала концентрация M-CSF (р=0,02) и IL-6 (р=0,04); содержание остальных цитокинов не связано с ИМТ. Уровень IL-6 положительно коррелировал с окружностью талии (r=0,4; р=0,006), содержанием мочевой кислоты (r=0,41; р=0,004) и триглицеридов (r=0,37; р=0,006).

Между концентрациями исследованных цитокинов прослеживались взаимные корреляции: M-CSF прямо коррелировал с MIP-1α (r=0,55; p<0,0001) и МIF (r=0,34; p=0,006); M-CSF и MIP-1α были связаны с IL-6 (r=0,59; p<0,0001 и r=0,61; p<0,0001).

Представленные данные свидетельствуют об увеличении концентрации цитокинов, регулирующих миграцию и адгезию макрофагов: M-CSF, MIP-1α и MIF, в сыворотке крови у больных СД-2. Уровень MIF повышен у больных с различной СКФ, содержание M-CSF и MIP-1α — только у пациентов со снижением СКФ в диапазоне 30—59 мл/мин/1,73 м². Концентрации M-CSF, MIP-1α и IL-6 увеличивались по мере роста альбуминурии и экскреции коллагена IV типа с мочой.

В ряде исследований зафиксирована активация синтеза рассматриваемых цитокинов в почках при С.Д. Установлено, что макрофагальная инфильтрация почечных клубочков и интерстициальной ткани у мышей с генетической моделью ожирения и СД-2 (db/db) сопровождается усилением экспрессии M-CSF [3, 18] и MIF [18]. У больных СД-2 с микроальбуминурией зафиксировано увеличение экскреции с мочой MIP-1α, моноцитарного хемоаттрактантного протеина (MCP-1) и других воспалительных цитокинов [19]. Увеличение экспрессии рецептора MIF CD74 в подоцитах обнаружено у индейцев Пима (этническая модель СД-2) [20].

Роль цитокинов в развитии ХБП объясняют способностью активировать воспалительные реакции и фиброгенез. Так, MIF стимулирует синтез IL-6, IL-1b и TNF-α в макрофагах [21], синтез связанного с TNF индуцирующего апоптоз лиганда (TRAIL) и MCP-1 в подоцитах и эпителиоцитах проксимальных канальцев [20], экспрессию трансформирующего β-фактора роста в мезангиоцитах [22]. Показано, что блокада MIF, а также рецептора M-CSF c-fms у мышей линии db/db приводит к торможению активации макрофагов в почках, подавлению воспалительных сигнальных путей и к уменьшению фиброгенеза [21, 23].

Причины изменений продукции цитокинов при СД неясны. В литературе обсуждается роль гипергликемии и дефицита инсулина как факторов, модифицирующих продукцию цитокинов. Показано, что высокий уровень глюкозы запускает синтез MIP-1α в эпителиоцитах проксимальных канальцев [24]. Индукция гипергликемии (клэмп-метод) у больных СД-1 сопровождалась повышением экскреции данного белка с мочой [25]. Кратковременная (4 ч) внутривенная инфузия инсулина снижала экспрессию MIP-1α в мононуклеарах крови у больных СД-2 [26]. Мы не выявили взаимосвязи концентрации цитокинов и показателей гликемического контроля, что может объясняться эффектом лечения СД и влиянием других факторов.

Существенное воздействие на уровень циркулирующих цитокинов оказывает ожирение. В нашем исследовании связь с выраженностью ожирения отмечена для M-CSF и IL-6. Корреляции IL-6 с окружностью талии, уровнем мочевой кислоты и триглицеридов согласуются с данными о роли этого цитокина в формировании инсулинорезистентности [27]. Известно, что адипоциты человека секретируют IL-6 [28], M-CSF [29], MIF [30] и другие цитокины. Дополнительным источником циркулирующих цитокинов при ожирении служат макрофаги, инфильтрирующие жировую ткань [30]. Продукция M-CSF в адипоцитах человека возрастает при переедании и увеличении массы жировой ткани [28]. В экспериментах на крысах линии Zucker (модель СД-2) обнаружено увеличение синтеза MIP-1α и IL-6 в околопочечной жировой клетчатке [31]. Таким образом, увеличение концентрации циркулирующих цитокинов может являться связующим звеном между ожирением, воспалением жировой ткани и снижением функции почек.

В литературе обсуждается роль генетических факторов в изменениях продукции цитокинов при СД. В промоторных участках генов цитокинов обнаружены полиморфные локусы, варианты нуклеотидов в которых определяют уровень спонтанной и индуцированной секреции цитокинов. Варианты генов цитокинов отличают больных СД-2 от общей популяции [32]. Выявлены взаимосвязи развития ДН у больных СД-2 и вариантами генов IL-6 174 G/C [33, 34].

Установление медиаторов, вовлеченных в развитие диабетического поражения почек, открывает новые перспективы в лечении таких больных. В качестве потенциальных мишеней для целенаправленной терапии ДН рассматриваются рецептор MIF CD74 [35], рецептор M-CSF c-fms [23] и другие медиаторы. Определение патогенетической, диагностической и прогностической значимости воспалительных цитокинов при ХБП — перспективное направление для дальнейших исследований.

Цитокиновый спектр сыворотки крови у больных СД-2 характеризуется повышением концентрации воспалительных цитокинов: M-CSF, MIP-1a, MIF и IL-6. Больные с СКФ в диапазоне 30—59 мл/мин/1,73 м² имеют более высокие уровни M-CSF и MIP-1α по сравнению с пациентами с СКФ >60 мл/мин/1,73 м². Уровень M-CSF, MIP-1α и IL-6 положительно коррелирует с ЭАМ и экскрецией с мочой коллагена IV типа. Полученные данные согласуются с концепцией об участии хронического воспаления в развитии диабетического поражения почек.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14−15−00082).