БМИ — болезнь минимальных изменений

МН — мембранозная нефропатия

ОПП — острое повреждение почек

ПГП — первичные гломерулопатии

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ТИС — тубулоинтерстициальный склероз

ФСГС — фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХБП — хроническая болезнь почек

CysC — цистатин

FITC — флюоресцеина изотиоцианат

IgA — IgA-нефропатия

NGAL — нейтрофильный липокалин, ассоциированный с желатиназой

SCr — концентрация креатинина в сыворотке крови

SCysC — концентрация цистатина С в сыворотке крови

С развитием молекулярной биологии, открытия и полной расшифровки генома человека медицинская наука, нефрология в частности, пришла к необходимости системного подхода к анализу патогенетических взаимоотношений. Информационные технологии предоставляют возможность анализировать сложные биологические системы, что позволит в ближайшие годы прийти к медицине формата П4: персонализированной, прогнозируемой, превентивной и партнерской [1]. В нефрологии результаты недавно проведенных исследований в области транскриптомики и протеомики позволили выявить ряд белков в сыворотке крови и моче, которые, не обязательно являясь участниками патологического процесса, позволяют идентифицировать и прогнозировать его течение. Использование данных молекул (биомаркеров) уже нашло широкое применение. В настоящее время накоплена убедительная доказательная база, позволяющая констатировать целесообразность применения таких веществ, как нейтрофильный липокалин, ассоциированный с желатиназой (NGAL), молекула повреждения почек (KIM-1), печеночный протеин, связывающий жирные кислоты (L-FABP), цистатин С (CysC), интерлейкин-18, в ранней диагностике и прогнозировании исходов у пациентов с острым повреждением почек (ОПП) [2, 3]. В последние годы предприняты попытки оценить роль перечисленных маркеров ОПП и у пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) [4—6]. Это связано с тем, что традиционные показатели, такие как уровни креатинина и мочевины в сыворотке крови, протеинурия (микроальбуминурия), скорость клубочковой фильтрации (СКФ), обладают рядом недостатков. Так, они позволяют констатировать повреждение почечной паренхимы лишь на поздних, необратимых этапах, обладают низкой информативностью в отношении поражения канальцевого аппарата и интерстициальной ткани, которое определяет прогноз заболевания и прогрессирование дисфункции почек [7—10].

Наше внимание в данном исследовании привлекли такие биомолекулы, как CysC и NGAL. Определение СКФ по концентрации CysC в некоторых ситуациях является более точным и обладает преимуществом по сравнению со стандартными методиками, основанными на измерении уровня креатинина, в частности позволяет избежать влияния таких факторов, как масса тела, раса, возраст [11]. По данным недавних экспериментальных исследований, NGAL может рассматриваться не только как «свидетель», но и как участник фиброза почечной ткани [12]. Не случайно в течение последних лет появились публикации, которые доказывают, что определение NGAL и CysC позволяет прогнозировать темпы прогрессирования дисфункции почек [5, 13, 14]. Работы, в которых проведено сопоставление уровня биомаркеров с морфологическими признаками склероза канальцев и интерстициальной ткани, носят единичный характер [15], особенно это касается пациентов с первичными нефропатиями [16].

Целью настоящего исследования явилось изучение ассоциаций между уровнем CysC и NGAL в сыворотке крови и суточной моче с клинико-морфологическими данными у пациентов с первичными гломерулопатиями (ПГП).

В исследование включали больных, госпитализированных в нефрологические отделения клиники пропедевтики внутренних болезней СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, у которых по данным диагностической биопсии почек выявлена ПГП. Критериями исключения являлись переносимое ОПП (в соответствии с критериями AKIN, 2007 г., классификацией ОПП НИИ нефрологии СПбГМУ им акад. И.П. Павлова [2]), онкологические заболевания, тяжелые инфекционные болезни, дисфункция щитовидной железы, злоупотребление алкоголем, сердечная недостаточность III—IV функционального класса (по классификации NYHA), снижение фракции выброса по данным эхокардиографии (<55% по Симпсону), дыхательная недостаточность более II степени.

Всего в исследование включили 104 пациента: 61 (58,7%) мужчина, 43 (41,3%) женщины, средний возраст 42±16,7 года.

В зависимости от морфологического варианта заболеваний почек больных распределили по следующим группам: 1-я (n=15; 14,4%) — болезнь минимальных изменений (БМИ), 2-я (n=24; 23,1%) — фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), 3-я (n=32; 30,8%) — мембранозная нефропатия (МН), 4-я (n=33; 31,7%) — мезангиопролиферативный гломерулонефрит (IgA-нефропатия). Проанализирован клинический вариант течения нефропатии (длительность заболевания, азотемии, наличия артериальной гипертонии, ее степень, длительность и характер мочевого синдрома, объем и эффект проводимой терапии, в том числе патогенетической), выполнены стандартные лабораторные и инструментальные исследования.

Уровни биомаркеров определяли в сыворотке крови и суточной моче, взятой утром в день проведения биопсии почек. Биоматериал собирали согласно стандартной методике, принятой при выполнении лабораторных тестов, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин, после чего проводили исследования, при необходимости материал аликвотировали и хранили при температуре –80 °С до исследования. Во всех образцах сыворотки и мочи измеряли концентрацию CysC и NGAL. Содержание CysC определяли методом иммунотурбидиметрии (наборы фирмы «Alfresa Pharma Соrporation», Япония) на приборе Furuno CA-90 («Furuno Electric Co., Ltd.», Япония), NGAL (наборы фирмы «BioVendor», Чешская Республика) — методом иммуноферментного анализа. Оптическую плотность образцов измеряли на полуавтоматическом ридере планшетного типа («ImmunoChem 2100», США). Содержание CysC исследовано у всех пациентов, NGAL — у 79. Исследования проводили на базе НИЛ биохимического гомеостаза организма НИИ нефрологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Для патогистологического исследования фрагменты почечной паренхимы фиксировали тотчас после получения образцов ткани в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере, рН 7,4 в течение 24 ч при комнатной температуре. После стандартной обработки тканевых фрагментов (обезвоживание и пропитка) из парафиновых блоков были приготовлены серийные срезы 4—5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (PAS), трихромальной окраской (Masson), по Джонсу, по Вейгерту (Veigert), Конго красным. Патоморфологические изменения изучали в светооптическом микроскопе Carl Zeiss Imager Z 2 (Германия). Патоморфологические изменения оценивали количественно и полуколичественно (0 — нет изменений, 1 — до 25% анализируемых срезов биоптата почек, 2 — до 50%, 3 — более 50 % анализируемого объекта), с учетом рекомендаций по оценке биоптата почек у больных с IgA-нефропатией [17]. Иммунофлюоресцентное исследование (прямая флюоресценция) осуществляли на криостатных срезах с использованием антител, меченных флюоресцеина изотиоцианатом — FITC («DAKO» Дания). Во всех биопсиях анализировали депозиты в структурах нефрона IgA, IgM, IgG, C3c, C1q, фибриногена, легких цепей κ и λ. Локализацию и интенсивность продукта реакции оценивали полуколичественно по интенсивности свечения флюорохрома (FITC — от 0 до +++). Для ультраструктурного анализа биоптаты почек фиксировали в альдегидном фиксаторе и после стандартной проводки заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы после контрастирования анализировали в трансмиссионном микроскопе Jeol-7A (Япония). Исследования проводили на базе НИЛ клинической иммунологии и морфологии НИИ нефрологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Статистическую обработку данных выполняли с применением пакетов программ прикладного статистического анализа Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Сравнение в группах проводили при нормальном распределении по t-критерию Стьюдента для связанных и несвязанных выборок, для множественных выборок использовали одно- и многофакторный дисперсионный анализ, апостериорные сравнения в группах проводили по критерию Тьюки. При распределении, отличном от нормального, использовали критерии Крускала—Уоллиса для множественного сравнения, в 2 группах — по критерию Манна—Уитни. Корреляционный анализ выполняли с использованием коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена в зависимости от распределения в группах. При анализе качественных переменных выполняли сравнение по критерию χ² и точному критерию Фишера. Данные в таблицах представлены в виде среднего и стандартного отклонения в случае нормального распределения и в виде медианы и межквартильного размаха — при распределении, отличном от нормального. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Данные клинико-лабораторного обследования пациентов представлены табл. 1.

СКФ была определена несколькими методами. Помимо клиренса креатинина и расчетного определения по формуле CKD-EPI использовали методы, основанные на измерении концентрации CysC в сыворотке крови: 1) по формуле Hoek: 0,35/ CysC в сыворотке (мг/л) – 4,32 [18]; 2) CKD-EPI (2012) по CysC; 3) CKD-EPI (2012) по CysC и креатинину в соответствии с рекомендациями KDIGO по ведению пациентов с ХБП [19] (табл. 2, 3).

При проведении корреляционного анализа между степенью выраженности гломерулосклероза и СКФ, определенной различными методами (табл. 6),

Наибольшая суточная экскреция CysC с мочой зафиксирована у пациентов с МН и ФСГС по сравнению с пациентами с БМИ. Уровень NGAL в сыворотке крови статистически значимо различался в группах с ФСГС и IgA-нефропатией. Суточная экскреция NGAL в моче была наибольшей у пациентов с ФСГС.

При проведении непараметрического многофакторного дисперсионного анализа и сравнении уровня экскреции CysC с мочой в зависимости от полуколичественной оценки атрофии канальцев (более и менее 50%), тубулярного склероза (более и менее 25%) и уровня протеинурии (более и менее 3 г) выявлена зависимость от степени атрофии и тубулярного склероза (p=0,0267). При апостериорном сравнении обнаружено статистически значимое различие между больными с минимальной выраженностью морфологических изменений и умеренной протеинурией и пациентами, у которых наблюдалась высокая протеинурия наряду с выраженной атрофией канальцев и ТИС.

При проведении корреляционного анализа между уровнем экскреции NGAL с мочой и СКФ также обнаружена корреляция, независимо от метода определения (r от –0,46 до –0,52; p<0,05), протеинурией (r=0,46; p<0,05), атрофией канальцев (r=0,36; p<0,05), гломерулосклерозом (r=0,42; p<0,05). Взаимосвязи уровня NGAL в моче с ТИС не выявлено. В ходе непараметрического многофакторного анализа, аналогичного выполненному при изучении экскреции CysC, также обнаружено различие между пациентами без атрофии канальцев и тубулярного склероза и теми, у кого эти изменения были выражены в максимальной степени.

При выделении группы больных с нефротическим синдромом выявлена корреляция гломерулосклероза и атрофии канальцев с концентраций NGAL в моче (r=0,37 и r=0,35 соответственно; p<0,05). Корреляция между уровнем NGAL в сыворотке крови и моче выявлена только в группе пациентов с ФСГС (r=0,50 и r=0,47 соответственно; p<0,05).

«Золотым стандартом» диагностики в нефрологии является морфологическое исследование биоптата почек. Вместе с тем биопсия не позволяет оценить функциональные изменения, которые в клинике определяют динамику патологического процесса и прогноз заболевания. Клиренс креатинина и его концентрация в сыворотке крови не теряют свою актуальность в оценке сформировавшегося ТИС, но они остаются маркерами поздних, необратимых стадий повреждения почек [10]. Это послужило причиной появления исследований по оценке возможности использования биомаркеров имеющегося повреждения канальцевой части нефрона в качестве предикторов течения хронической патологии почек [3]. В одной из первых работ на основании проспективного исследования с участием больных с ХБП II—IV стадии, обусловленной различными нефропатиями, в том числе ПГП, доказана прогностическая ценность использования концентрации NGAL как в сыворотке крови, так и в утренней порции мочи в качестве предиктора прогрессии дисфункции почек [5]. Имеются также данные об информативности уровня NGAL в сыворотке крови и моче для определения активности заболевания [20]. При обследовании пациентов с МН и мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом с протеинурией более 1 г/сут выявлена корреляция уровня NGAL в моче и протеинурии, доказана возможность использования концентрации NGAL в качестве предиктора ухудшения функции почек [4, 13]. В то же время мало внимание уделяется изучению взаимосвязи экскреции биомаркеров с характером морфологических изменений при ПГП. Так, при обследовании пациентов с IgA-нефропатией выявлена роль уровня NGAL в качестве предиктора ТИС [16].

В данной работе мы не обнаружили четкой взаимосвязи между экскрецией NGAL и концентрации CysC в моче с ТИС; корреляция с атрофией канальцев выявлена только для содержания NGAL в моче. Статистически значимая корреляция мочевой экскреции CysC и NGAL с СКФ и гломерулосклерозом, с одной стороны, и одновременное отсутствие корреляции с морфологическими изменениями канальцев, — с другой, не вполне укладываются в традиционные представления о механизмах повышения экскреции данных биомаркеров в моче. В норме CysC свободно фильтруется в клубочке, затем полностью метаболизируется в проксимальных канальцах в процессе реабсорбции и не экскретируется. Увеличение его уровня в моче свидетельствует о нарушении реабсорбции в канальцах, что косвенно отражает их дисфункцию [21—23]. Однако ни в одной из указанных работ авторы не проводили детальной оценки морфологических данных. Кинетика NGAL несколько более сложна, так как после реабсорбции в проксимальных канальцах он поступает в кровь, формируя так называемый системный пул, оценить который можно по концентрации NGAL в сыворотке крови. Кроме того, в условиях острого или хронического повреждения эпителиоцитов дистальных канальцев активируются процессы местного (локального) синтеза NGAL. Таким образом, концентрация NGAL в моче может быть обусловлена не только нарушением его реабсорбции в проксимальных канальцах, но и активацией синтеза в клетках поврежденного эпителия дистальных отделов нефрона. В ранее опубликованных работах [24, 25] высказывалось положение о том, что экскреция NGAL с мочой может отражать активное и в то же время потенциально обратимое повреждение клеток канальцевого эпителия. Данный факт в настоящем исследовании подтверждает взаимосвязь между СКФ и концентрацией NGAL в моче. К аналогичным выводам мы пришли и в нашей предыдущей работе, выполненной в менее многочисленной группе пациентов [26]. Мы обратили внимание на ассоциацию концентрации как NGAL, так и CysC в моче с уровнем протеинурии, что объяснили как активным повреждением канальцев за счет протеинурии (механизм которого в настоящее время хорошо изучен [27]), так и нарушением реабсорбции NGAL и CysC в проксимальных канальцах. Причиной последнего является описанный в литературе механизм конкуренции этих веществ с альбумином за эндоцитоз, опосредованный мегалином и кубилином [28, 29]. Вместе с тем данные многофакторного непараметрического анализа и частной корреляции с включением протеинурии позволили предположить, что активное повреждение канальцев служит более значимым механизмом. При этом концентрация CysC отражает исключительно функциональную и, следовательно, обратимую дисфункцию клеток эпителия канальцев, тогда как экскреция NGAL с мочой в большей степени свидетельствует о необратимой атрофии канальцев. Полученные данные позволяют иначе интерпретировать данные проспективных исследований с участием пациентов с первичными вариантами нефропатии, у которых именно уровень мочевой экскреции NGAL определял прогноз прогрессирования дисфункции почек, тогда как протеинурия, азотемия и СКФ такой прогностической ценностью не обладали [13]. Очевидно, не случайно пациенты с БМИ, у которых уровень экскреции CysC в моче был меньше, чем при ФСГС и МН, имеют более благоприятный функциональный прогноз.

В одном из метаанализов, посвященных диагностике ОПП, указывалось, что определение концентрации NGAL в моче является предпочтительным [30]. В исследованиях с участием пациентов с первичными гломерулопатиями анализировалась преимущественно концентрация NGAL в моче [4, 13]. Ранее нами показано, что уровень NGAL в сыворотке крови также способен отражать повреждение клеток клубочкового аппарата [25]. Данные некоторых экспериментальных исследований продемонстрировали роль NGAL как непосредственного участника развития фиброза не только тубулоинтерстиция, но и клубочкового аппарата [12]. Это объясняется активацией транскрипции гена NGAL — фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1α), что ведет к пролиферации клеток и усугублению склероза [31]. Результаты настоящего исследования, проведенного с участием большого числа пациентов, подтверждают высказанные нами ранее предположения. Об этом свидетельствует то, что у пациентов с нефротическим синдромом уровень NGAL в сыворотке крови отражает наличие гломерулярного склероза, а также атрофии канальцев. Корреляция уровня NGAL в сыворотке крови и моче у больных с ФСГС в сочетании с наиболее высоким уровнем в моче CysC может указывать на активацию процессов повреждения канальцев у больных данной категории, которое определяет прогноз и укладывается в представление о ФСГС как наиболее неблагоприятном варианте первичной гломерулопатии.

В этом отношении ассоциация гломерулосклероза с уровнем NGAL в сыворотке крови и СКФ, определенной по CysC и креатинину, позволяет расценивать последнюю как наиболее объективно отражающую степень как раннего, так и необратимого повреждения клубочков почек.

Считается, что метод оценки СКФ по CysC имеет ряд преимуществ по сравнению с клиренсом креатинина. Однако оценка СКФ в больших группах пациентов не позволила отнести метод оценки СКФ по CysC к «золотому стандарту», поскольку полученные данные свидетельствовали о влиянии на его концентрацию множества других факторов (пол, расовая принадлежность и др.). При обследовании большой когорты пациентов установлено, что предпочтительным является расчет СКФ по формуле, учитывающей концентрацию как CysC, так и креатинина [32]. Не случайно последние рекомендации KDIGO по ведению пациентов с ХБП относят данный способ расчета СКФ к референтной методике [19].

Состояние тубулоинтерстициального компартмента при ПГП следует определять не только по морфологическим изменениям, но и путем оценки функционального состояния канальцевого аппарата почек с помощью определения экскреции биомаркеров с мочой. Содержание CysC в моче отражает функциональное повреждение эпителия канальцев, тогда как уровень NGAL в моче характеризует наличие атрофии канальцев. С целью оценки выраженности гломерулосклероза наиболее предпочтительно использование СКФ, определенной путем расчета исходя из концентраций CysC и креатинина в крови с учетом клинических данных (формула CKD-EPI, 2012; см. табл. 2).