Разработка методики анализа мочи с использованием ВЭЖХ-МС/МС при лабораторной диагностике острых пероральных отравлений мухоморами

Сбор и употребление в пищу мухоморов становятся все более популярными из-за такого социального явления, как «микродозинг», которое активно пропагандируется в сообществах, связанных с биохакингом, альтернативной медициной. Абсолютная легальность сбора, хранения, реализации и употребление мухоморов в рекреационных целях в галлюциногенных дозировках приводят к росту числа острых пероральных отравлений [1, 2]. Основными психоактивными компонентами мухоморов являются: мусцимол, агонистом ГАМК_А-рецепторов, угнетает центральную нервную систему, и иботеновая кислота, которая по механизму действия является агонистом глутаматных NMDA-рецепторов и известна своими нейротоксическими свойствами [3—6]. Иботеновая кислота преобразуется в мусцимол путем декарбоксилирования во время сушки сырья и в организме.

При пероральном приеме иботеновая кислота и мусцимол быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта и могут быть обнаружены в моче в течение 1 ч после употребления. Они легко проходят через гематоэнцефалический барьер, поэтому клиническая картина отравления Amanita muscaria и A. pantherina, кроме периферических эффектов мускарина, проявляется галлюцинациями, спутанностью сознания, возбуждением, судорогами и комой [7, 8]. Хотя отравления мухоморами довольно редко приводят к летальному исходу, однако из-за остаточного содержания иботеновой кислоты высокие дозы сушеных мухоморов могут быть смертельными [1, 6]. Токсические и летальные дозы мухомора могут сильно варьироваться, поскольку зависят от множества факторов, включая индивидуальную чувствительность, массу тела, способ сушки и место произрастания гриба.

Химико-токсикологический анализ является обязательным элементом клинико-лабораторной диагностики согласно Приказу Минздравсоцразвития РФ от 27.01.2006 №40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ» и Приказу Минздрава России от 18.12.2015 №933н (ред. от 25.03.2019) «О порядке проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического)» [9—12].

Цель исследования — разработка методики лабораторной диагностики острых отравлений мухоморами при анализе мочи с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС).

Исследование выполняли на модульном жидкостном хроматографе Nexera XR с тандемным масс-спектрометром LCMS-8050 (Shimadzu, Япония): колонки Shim-pack FC-ODS (2×150 мм, 3 мкм), дегазатор, автосамплер (объем инъекции: 10 мкл); масс-спектрометр электрораспылительной ионизации (ESI), скорость потоков газа-распылителя и осушающего газа (азот) 1,5 и 10 л/мин соответственно; фаза A (0,1% об. муравьиной кислоты в воде) и фаза B (ацетонитрил): линейный градиент с 5 до 90% B (10 мин); программное обеспечение LabSolution (Shimadzu, Япония); энергия соударения (СЕ) 30 эВ.

В качестве объектов исследования использовали мочу пациентов, собранную согласно п. 10 (на основании анамнеза и клинической картины) Приказа Минздрава России от 15.11.2012 № 925н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи больным с острыми химическими отравлениями» Отдела клинической токсикологии ГБУ «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института скорой помощи им. И.И. Джанелидзе». Дериватизацию проводили по следующей методике: к 1 мл пробы добавляли 500 мкл воды, 500 мкл 5% карбоната натрия и 300 мкл 30 mM дансилхлорида в ацетоне, тщательно перемешивали и инкубировали 30 мин при 60 °C, охлаждали 10 мин при комнатной температуре и останавливали процесс дериватизации добавлением 10 мкл концентрированной серной кислоты. Прибавляли 2 мл дихлорметана, тщательно перемешивали 10 мин на мультиротаторе MultiBioRS-24 и центрифугировали (3000 об/мин, 3 мин), отбирали дозатором нижний слой и выпаривали до сухого остатка, растворяли в 500 мкл фазы А, 10 мкл вводили в инжектор хроматографа.

Использование MRM (Multiple Reaction Monitoring) — подхода, основанного на последовательном мониторинге определенных фрагментов ионизированных молекул, позволяет получать более точные и воспроизводимые результаты. Мусцимол и иботеновая кислота по своей химической природе — это низкомолекулярные, полярные и гидрофильные вещества. Сложность их анализа на колонке С18 состоит в том, что они выходят в «мертвое» время (1 мин). Кроме того, иботеновая кислота химически нестабильна и легко декарбоксилируется до мусцимола. Для улучшения хроматографических характеристик анализируемых веществ применяли дериватизацию образца, что позволило решить проблемы термической нестабильности и слабого удерживания аналитов на обращенно-фазовой колонке [13—15].

В результате проведения дериватизации были получены дансилпроизводные иботеновой кислоты (рис. 1 на цв. вклейке) и мусцимола (рис. 2 на цв. вклейке) в образце мочи.

Рис. 1. Хроматограмма (а) и спектр ионов-продуктов иботеновой кислоты (б).

Энергия соударения (СЕ) — 30 эВ. На хроматограмме отмечается пик дансилпроизводного иботеновой кислоты.

Рис. 2. Хроматограмма (а) и спектр ионов-продуктов мусцимола (б).

Энергия соударения (СЕ) — 30 эВ. На хроматограмме отмечается пик дансилпроизводного мусцимола.

Определяемые дериваты дают воспроизводимый отклик прибора, превышающий или равный 3-кратному уровню фонового шума (оценивается по значению S/N) и соответствуют критериям обнаружения (время удерживания, форма пика, масс-спектральные отношения) (см. таблицу) [16, 17].

Результаты определения пригодности хроматографической системы по приведенным параметрам

Таким образом, была разработана методика определения иботеновой кислоты и мусцимола в моче для целей лабораторной диагностики острых отравлений мухоморами. Установлено, что для получения удовлетворительных результатов по показателям: эффективность, наличие «хвоста пика» (показатель симметрии), высота, эквивалентная теоретической тарелке, отношение сигнал/шум необходимо проводить дериватизацию с получением дансилированных производных и последующим анализом ВЭЖХ-МС/МС. Проведена валидация методики по параметру пригодности хроматографической системы (время удерживания и сигнал/шум). Пик иботеновой кислоты со временем удерживания (RT) около 6,2 мин и мусцимола со временем удерживания 7,5 мин имеют отношение сигнал/шум (S/N) >3, как показано в таблице [16].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.