Введение
Установление зависимости сигнала прибора от концентрации аналита в образцах для градуировки является неотъемлемой частью перед проведением количественного химического анализа. Градуировочная характеристика — это зависимость выходного аналитического сигнала от входного, т.е. от концентрации [1, 2]. В бюро судебно-медицинской экспертизы и химико-токсикологических лабораториях количественное определение массовой концентрации этанола проводится практически ежедневно [3, 4] в биологических жидкостях живых лиц [5] и трупов [6]. Документированные методики [7—9], которые устанавливают данную процедуру, требуют получения достоверных результатов на основе построения градуировочных графиков.
Качественное проведение процедуры градуировки позволяет осуществить Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 11095-2007 «Статистические методы. Линейная калибровка с использованием образцов сравнения». Положения настоящего стандарта, касающиеся калибровки, могут быть отнесены и к градуировке [10]. Поскольку рабочий диапазон методик для количественного определения этанола, аттестованных на территории нашей страны, представляет собой линейную зависимость отклика детектора от разных концентраций водноспиртовых растворов, вышеуказанный стандарт может быть применен для постановки эксперимента по калибровке, где растворы этанола будут выступать в качестве образца сравнения (Reference Material, RM) — материала или вещества, одно или несколько свойств которого установлены достаточно надежно для использования при валидации измерительной системы.
Цель работы — проведение эксперимента по калибровке в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11095-2007, с применением внутренних RM — водных растворов этанола в разных концентрациях (RM, разработанные пользователем для его внутреннего использования); оценка параметров линейной функции калибровки.
Материал и методы
Методика измерения
Эксперимент по калибровке проводили согласно аттестованной методике ФР.1.31.2014.18053 «Методика качественного обнаружения и измерения концентрации спиртов в крови и моче методом газожидкостной хроматографии на аппаратно-программном комплексе «Хроматэк-Кристалл»». Диапазон измерений составлял от 0,2 до 6‰ (промилле, мг/мл). В основе методики лежал алкилнитритный метод [8].
Приготовление внутренних образцов сравнения
Объектами исследования служили внутренние RM этанола, изготовленные из 95% этанола, предназначенного для лекарственных форм. Температуру этанола измеряли ртутным термометром ТЛ-2; ареометром АСП-1 90—100% (ГОСТ 18481-81) при температуре 20 °C проверяли его объемный процент, по которому находили массовую концентрацию, пользуясь алкоголеметрической таблицей 1 ГФ XIII издания. Готовили 2% раствор этанола в мерной колбе на 100 мл (ГОСТ 1770-74), отбирая необходимый объем исходного спирта пипеточным дозатором Eppendorf. Для полного охвата диапазона значений, прописанного в методике, из 2% раствора готовили RM, соблюдая правило эквидистантных концентраций [1], для 1-го поддиапазона — 0,15—1,05 мг/мл, для 2-го поддиапазона — 1,0—7,0 мг/мл, в мерных колбах на 50 мл (ГОСТ 1770-74), отбирая необходимый объем 2% спирта пипеточными дозаторами Eppendorf. Все средства измерения на момент эксперимента имели действующую поверку.
Пробоподготовка
В пенициллиновый флакон вместимостью 10 мл вносили 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,5 мл RM с определенной концентрацией, 0,5 мл 4‰ внутреннего стандарта пропанола-1. Флакон немедленно закрывали резиновой пробкой, устанавливали его через боковой паз в штатив и прижимали крышку, закручивая верхнюю гайку. Далее вручную энергично взбалтывали содержимое флакона в течение 3—5 с. Непосредственно перед анализом вводили шприцем через пробку 0,3 мл 30% раствора нитрита натрия, энергично встряхивали флакон в горизонтальной плоскости (маятникообразным движением) в течение 3—5 с, оставляли на 1 мин.
Условия хроматографирования
Исследования проводили на газовом хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000.1» с детектором по теплопроводности (катарометр), колонка насадочная M ss316 2,0 m × 2,0 mm 10% ДНФ на хроматоне N AW DMCS 0,16/0,2. Температура испарителя составляла 100 °C, колонки — 90 °C, детектора — 150 °C. Расход газа-носителя (гелий) составлял 24 мл/мин. Длительность анализа — 3 мин.
Расчет хроматограмм
Эксперимент по калибровке выполняли для двух поддиапазонов концентраций этанола на RM: 0,15—1,05 и 1,0—7,0 мг/мл. Каждый из них был измерен 4 раза. Количественное определение концентрации этанола в каждом RM проводили методом внутреннего стандарта с использованием 4‰ пропанола-1. С помощью ПО «Хроматэк аналитик 2.6» проводили ручную корректировку разметки хроматографических пиков. Значения высот пиков получали путем интегрирования, определяли время начала и конца пиков. В ПО MS Excel рассчитывали площади пиков, за результат измерения на каждом RM принимали значение отношений площадей S/Sвн.ст.
Результаты и обсуждение
Повторения на RM были распределены по недельному интервалу для обеспечения независимости измерений. Данные, представленные в табл. 1, состояли из 4 повторений измерений (K=4) на 7 RM (N=7) для 1-го поддиапазона (0,15—1,05 мг/мл) и для 2-го поддиапазона (1,0—7,0 мг/мл).
Таблица 1. Данные эксперимента по калибровке для двух поддиапазонов RM (N=7, K=4)
| Значение Xn, мг/мл | Результаты измерений, 1-й поддиапазон | |||
| повторение 1 | повторение 2 | повторение 3 | повторение 4 | |
| 0,15 | 0,0181 | 0,0170 | 0,0154 | 0,0194 |
| 0,30 | 0,0502 | 0,0431 | 0,0509 | 0,0448 |
| 0,45 | 0,0765 | 0,0746 | 0,0844 | 0,0853 |
| 0,60 | 0,1164 | 0,1177 | 0,1058 | 0,1160 |
| 0,75 | 0,1600 | 0,1614 | 0,1734 | 0,1662 |
| 0,90 | 0,1964 | 0,1966 | 0,2012 | 0,2246 |
| 1,05 | 0,2609 | 0,2505 | 0,2357 | 0,2428 |
| Значение Xn, мг/мл | Результаты измерений, 2-й поддиапазон | |||
| повторение 1 | повторение 2 | повторение 3 | повторение 4 | |
| 1,0 | 0,2586 | 0,2521 | 0,2667 | 0,2612 |
| 2,0 | 0,4933 | 0,5799 | 0,6582 | 0,6282 |
| 3,0 | 0,8838 | 0,9017 | 1,0083 | 1,0184 |
| 4,0 | 1,4536 | 1,4388 | 1,3993 | 1,4590 |
| 5,0 | 1,7800 | 1,8038 | 1,7192 | 1,6947 |
| 6,0 | 2,1689 | 2,1836 | 2,1139 | 2,0541 |
| 7,0 | 2,3972 | 2,3262 | 2,8000 | 2,0855 |
Примечание. Здесь и в табл. 2—4, а также на рис. 1, 2: K — число повторений измерений; N — число RM. Жирным шрифтом выделены значения RM, передающие концентрации 0,15 и 7,0 мг/мл, которые были исключены из результатов эксперимента.
Значения RM, передающих концентрации 0,15 и 7,0 мг/мл (выделены жирным шрифтом), были исключены из результатов эксперимента. Было выявлено, что при расчетах эти значения RM вносили вклад в увеличение дисперсии отклонения от модели относительно дисперсии истинной ошибки в каждом поддиапазоне соответственно. Это явление объясняется заявленным диапазоном методики измерений — 0,2—6,0 мг/мл. Далее представлены результаты, полученные на 4 повторениях измерений на 6 RM для 1-го поддиапазона (0,30—1,05 мг/мл) и для 2-го поддиапазона (1,0—6,0 мг/мл) (см. табл. 1).
В соответствии с формулами ГОСТ Р ИСО 11095-2007 п. 6.2.2:
— для 1-го поддиапазона: a) N = 6, K = 4; b) x = 0,675; c) значения yi приведены в табл. 2; d) y = 0,143; e) SSE = 0,0017; f) β1 = 0,2716; g) β0 = –0,0402; h) σ2 = 0,79∙10–4;
— для 2-го поддиапазона: a) N = 6, K = 4; b) x = 3,5; c) значения yi приведены в табл. 2; d) y = 1,187; e) SSE = 0,0787; f) β1 = 0,3804; g) β0 = –0,144; h) σ2 = 0,0036.
Таблица 2. Значения yi для двух поддиапазонов RM (N=6, K=4)
| 1-й поддиапазон | 2-й поддиапазон | ||
| i | yi i | i | yi |
| 1 | 0,047 | 1 | 0,260 |
| 2 | 0,080 | 2 | 0,590 |
| 3 | 0,114 | 3 | 0,953 |
| 4 | 0,165 | 4 | 1,438 |
| 5 | 0,205 | 5 | 1,749 |
| 6 | 0,247 | 6 | 2,130 |
Графики данных, собранных в процессе эксперимента (рис. 1), не указывали на наличие очевидных выбросов или необычное поведение системы (нарушение линейности) в процессе эксперимента по калибровке. Графики функций калибровки согласовывались с предположением о линейности функции калибровки. Функция калибровки:
Рис. 1. Графики функций калибровки в предположении о линейности для двух поддиапазонов RM (N=6, K=4).
— для 1-го поддиапазона:
y = 0,2716x – 0,0402;
— для 2-го поддиапазона:
y = 0,3804x – 0,144.
Значения yn получены заменой х в этих формулах на значения xn (см. табл. 1).
Значения остатков (табл. 3) были получены по формуле:
enk = ynk – yn.
Таблица 3. Линейная калибровка в предположении о постоянстве стандартного отклонения остатков для двух поддиапазонов RM (N=6, K=4)
| 1-й поддиапазон | Значение остатка | ||||
| Значение xn, мг/мл | Значение yn | en1 | en2 | en3 | en4 |
| 0,30 | 0,041 | 0,0089 | 0,0018 | 0,0096 | 0,0035 |
| 0,45 | 0,082 | –0,0055 | –0,0074 | 0,0024 | 0,0033 |
| 0,60 | 0,123 | –0,0064 | –0,0051 | –0,0170 | –0,0068 |
| 0,75 | 0,164 | –0,0035 | –0,0021 | 0,0099 | 0,0027 |
| 0,90 | 0,204 | –0,0078 | –0,0076 | –0,0030 | 0,0204 |
| 1,05 | 0,245 | 0,0159 | 0,0055 | –0,0093 | –0,0022 |
| 2-й поддиапазон | Значение остатка | ||||
| Значение xn, мг/мл | Значение yn | en1 | en2 | en3 | en4 |
| 1,0 | 0,236 | 0,0226 | 0,0161 | 0,0307 | 0,0252 |
| 2,0 | 0,616 | –0,1227 | –0,0361 | 0,0422 | 0,0122 |
| 3,0 | 0,996 | –0,1122 | –0,0943 | 0,0123 | 0,0224 |
| 4,0 | 1,376 | 0,0776 | 0,0628 | 0,0233 | 0,0830 |
| 5,0 | 1,756 | 0,0240 | 0,0478 | –0,0368 | –0,0613 |
| 6,0 | 2,136 | 0,0329 | 0,0476 | –0,0221 | –0,0819 |
Графики остатков (рис. 2) представляли собой беспорядочно распределенные точки, сосредоточенные вокруг нуля, поэтому предположение о постоянстве стандартного отклонения остатков является справедливым для двух поддиапазонов RM.
Рис. 2. Графики остатков в предположении о постоянстве стандартного отклонения остатков для двух поддиапазонов RM (N=6, K=4).
В табл. 4 приведены результаты дисперсионного анализа ANOVA (ANalysis of VAriance, статистического метода, который используется для сравнения средних значений двух или более выборок) для модели с постоянным стандартным отклонением остатков в соответствии с п. 6.5.3.
Таблица 4. Таблица ANOVA для сравнения дисперсий в предположении о постоянстве стандартного отклонения остатков для двух поддиапазонов RM (N=6, K=4)
| Параметр | Число ст. свободы | Сумма кв. отклонений, SS | SS/DF | Отношение F |
| 1-й поддиапазон: 0,30—1,05 мг/мл | ||||
| Функция калибровки | 1 | SSR = 0,11618 | ||
| Остаток | 22 | SSE = 0,00173 | σ2 = SSE/22 = 0,00008 | |
| Отклонение от модели | 4 | SSE — SSP = 0,0005 | σ2l = SSE — SSP/4 = 0,00013 | σ2l/σ2p=1,843 |
| Чистая ошибка | 18 | SSP = 0,00123 | σ2p = SSP/18 = 0,00007 | 2,93 |
| Итого | 23 | SST = 0,11791 | ||
| 2-й поддиапазон: 1,0–6,0 мг/мл | ||||
| Функция калибровки | 1 | SSR = 10,13166 | ||
| Остаток | 22 | SSE = 0,07868 | σ2 = SSE/22 = 0,00358 | |
| Отклонение от модели | 4 | SSE — SSP = 0,02787 | σ2l = SSE — SSP/4 = 0,00697 | σ2l/σ2p =2,468 |
| Чистая ошибка | 18 | SSP = 0,05082 | σ2p = SSP/18 = 0,00282 | 2,93 |
| Итого | 23 | SST = 10,21035 | ||
Дисперсия остатков, обусловленная неадекватностью функции калибровки σ2l, оказалась меньше, чем дисперсия данных, обусловленная чистой ошибкой σ2p. Отношение σ2l / σ2p — меньше F0,95 (4,18) = 2,93. Это подтверждает предположения о линейности функции калибровки (см. табл. 4), а также факт того, что оснований для отклонения полученных линейных моделей нет.
Выводы
1. В ходе проведения эксперимента по калибровке в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11095-2007 с использованием внутренних образцов сравнения этанола в двух поддиапазонах концентраций: 0,30—1,05 мг/мл и 1,0—6,0 мг/мл — было подтверждено предположение о линейности функции калибровки.
2. Полученные линейные модели y = 0,2716x – 0,0402 и y = 0,3804x – 0,144 в ходе эксперимента по калибровке могут быть рекомендованы к применению на практике, если оснований для их отклонения статистически не установлено.
3. По завершении эксперимента по калибровке, результаты измерений новых неизвестных величин должны быть преобразованы в соответствии с функциями калибровки. Преобразование этих результатов должно дать единственное значение Х0*, которое является оценкой истинного значения неизвестной величины (массовой концентрации этанола).
4. Для проверки действительности данных функций калибровки должен быть применен метод контроля, без которого валидация функции калибровки не является выполненной в полном объеме.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.