Установление динамики активности и стабильности проб ПСАобщ в образцах спермы на марле, разведенных дистиллированной водой

С целью установления наличия спермы на вещественных доказательствах в практику работы судебно-экспертных организаций Российской Федерации постепенно внедряются современные высокотехнологичные методы, в частности метод количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и колориметрический метод, которые с конца прошлого столетия широко используются за рубежом [1—3]. В последнее десятилетие в нашей стране разрабатываются методы внутрилабораторного контроля качества количественных методов исследования биологических объектов (крови, слюны, спермы) и совершенствуются способы судебно-цитологических исследований, которые необходимо применять при проведении судебно-биологических экспертиз вещественных доказательств [4—7].

Принцип ИФА заключается в образовании специфического иммунного комплекса с использованием иммобилизованных простатспецифических антигенов (ПСА) — антител, а также моноклональных ПСА — антител, меченых пероксидазой. Этот комплекс выявляют посредством окраски с помощью рабочего раствора тетраметилбензидина, после чего в лунки полистирольного планшета вносят стоп-реагент. Регистрацию результатов реакции осуществляют фотометрически на регистрирующем приборе при длине волны 450 нм с введением результатов в компьютерную базу данных [8—16]. При исследовании пятен, подозрительных на сперму, методом ИФА в качестве экстрагента можно использовать дистиллированную или деионизированную воду.

Изучение стабильности концентрации и активности ПСА_общ при хранении проб в разных условиях является актуальной задачей, поскольку позволяет избежать возможных ошибок при выявлении компонентов спермы на вещественных доказательствах в процессе производства судебно-биологических экспертиз. Вопрос валидации на преаналитической стадии при исследовании концентрации ПСА_общ в буферных или водных экстрактах в настоящее время практически не изучен.

Цель исследования — изучение продолжительности хранения проб (вытяжек), изготовленных из исследуемых образцов спермы на основе дистиллированной воды и исследование изменения и активности ПСА_общ.

Образцы семенной жидкости разводили дистиллированной водой с pH 7,4 в соотношении 1:1 (высокая концентрация) и 1:25 (низкая концентрация). Разведенную вышеуказанным способом семенную жидкость в количестве 1 мкл наносили на кусочки стерильной марли размером 0,5×0,5 см и высушивали при комнатной температуре (+18—20 °C). Затем помещали в пробирки типа Эппендорф и заливали дистиллированной водой с pH 7,4 в количестве 100 мкл. Экстрагировали в течение 18 ч в условиях бытового холодильника (+4—5 °C). Затем пробы вынимали из холодильника и хранили при комнатной температуре (+18—20 °C) в течение 6 ч. После чего производили измерение концентрации ПСА_общ в вытяжках посредством ИФА.

Исследование стабильности ПСА_общ проводили пятикратно в течение рабочего дня в промежуток времени с 9 до 15 ч по 5 репликатов в каждой серии с экстракцией дистиллированной водой. Статистическую обработку и валидацию данных осуществляли в соответствии с методиками оценки процедур контроля качества и верификации с применением вычисления: среднего значения — X‾ (average value), стандартного отклонения — SD (standart deviation), коэффициента вариации — CV% (coefficient of variation), ошибки среднего — SEM (standart error of the mean), метода регрессионного анализа, дисперсионного анализа и метода ANOVA, принятых при процедурах контроля качества в клинико-диагностических лабораториях. Статистическую значимость различий CV% оценивали по t-критерию Стьюдента и F-критерию Фишера. Активность изменения ПСА_общ в водных экстрактах при разной продолжительности хранения рассматривали как процент снижения концентрации от результата в 1-й серии опыта до последнего измерения в 6-й серии. За 100% принимали результат первого измерения 1-й серии каждого опыта.

Стабильность проб оценивается с помощью измерения параметров тестируемых компонентов в определенные промежутки времени и оценки стандартного отклонения (SD) для установления временного интервала, в течение которого измеряемый показатель будет показывать приемлемые результаты. Изучение стабильности позволяет получить промежуток времени, необходимый для проведения качественного проведения измерений исследуемых показателей, а также для оценки процедуры верификации. При исследовании стабильности проводили измерение концентрации ПСА_общ в экстрактах в количестве 5 серий в течение рабочего дня, по 5 репликатов в каждой серии.

Данные активности и точностные характеристики повторных измерений в динамике экстрактов ПСА_общ с высоким и низким содержанием ПСА_общ, полученные при использовании в качестве экстрагента дистиллированной воды, представлены в таблице.

Показатели активности и стабильности ПСА_общ в вытяжках из пятен спермы на марле, разведенной дистиллированной водой

Результаты проведенного исследования показали, что оба уровня концентрации снижались достаточно значительно в течение рабочего дня. Статистически значимое различие снижений уровней концентрации при исследовании низких уровней ПСА_общ наблюдалось уже к 10:30 (p<0,004), усиливалось к 12:00 (p<0,001) и 15:00 (p<0,001). Для высоких уровней ПСА_общ различие наблюдалось также уже к 10:30 (p<0,002), усиливалось к 12:00 (p<0,001) и 15:00 (p<0,001).

Суммарный внутрисерийный CV% составил 7,8% для низких концентраций ПСА, что было достоверно выше по сравнению с 1,8% для высоких (p<0,05).

Активность ПСА_общ через 1,5 ч уменьшилась до 94,6% в высоких и до 80,6% в низких концентрациях. К концу рабочего дня (через 6 ч) активность ПСА составила 69,7 и 51,6% соответственно.

Таким образом, активность ПСА_общ в водных экстрактах семенной жидкости на основе дистиллированной воды в течение рабочего дня может упасть на 30—48% (в зависимости от концентрации) при хранении проб при комнатной температуре (+18—20 °C).

В процессе выполнения исследования было установлено, что в образцах спермы на марле, разведенных дистиллированной водой, происходит постепенное снижение уровня содержания (активности) ПСА_общ в течение 6 ч при температуре +18—20 °C. При этом пробы с высокой концентрацией ПСА_общ пригодны для его определения методом ИФА на протяжении 4 ч, а пробы с низкой концентрацией ПСА_общ — на протяжении 2 ч 30 мин.

Полученные результаты исследования могут быть учтены при проведении судебно-биологических экспертиз по установлению наличия спермы на вещественных доказательствах методом ИФА и значительно повысить их эффективность.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.