Судебно-химическое и химико-токсикологическое исследование методом ВЭЖХ-МС/МС при отравлении рицином

Рицин (ricin) — ядовитое вещество растительного происхождения мощного действия. Представляет собой природный, чрезвычайно токсичный белок, содержащийся в семенах клещевины (Ricinus communis) [1], высокомасличной технической культуры. Из клещевины получают касторовое масло, которое используется в медицине [2].

Рицина в семенах клещевины может содержаться до 3%. Кроме того, в них присутствуют от 0,1 до 1% токсического алкалоида со схожим действием — рицинина (C₈H₈O₂N₂), который экстрагируется совместно с рицином, и триглицерид рицинолевой кислоты, который до 85% обнаруживается в касторовом масле. Таким образом, при отравлении семенами клещевины возможно обнаружение рицина, рицинина и рицинолевой кислоты совместно.

В России из семян клещевины производится в качестве лекарственного средства касторовое масло с международным непатентованным названием «Клещевины обыкновенной семян масло». Оно относится к фармакотерапевтической группе «слабительное средство растительного происхождения» [3]. Его специфичность обусловлена тем, что в нем преобладает (81—86%) рицинолевая (рицинолеиновая) кислота (C₁₈H₃₄O₃), которая не встречается в маслах других растений, в том числе растений семейства молочайные: тунг, молочай лекарственный [4].

Рицин состоит из двух полипептидов, связанных дисульфидной связью, с разными функциями. А-цепь проникает в цитозоль и ферментативно инактивирует рибосомы, тогда как В-цепь обладает свойствами лектина и связывается с углеводами на поверхности клетки. Молекула рицина представляет собой гликозилированный глобулярный гетеродимер массой 60—65 кДа. Массы цепей А и В приблизительно равны 32 и 34 кДа соответственно.

Рицин обладает прямым цитотоксическим эффектом вследствие ферментативного воздействия на эукариотические рибосомы, что приводит к ингибированию синтеза белка. Учитывая механизм цитотоксической активности рицина, это был самый первый идентифицированный RIP (рибосомно-инактивирующий белок), отнесенный ко II классу этой группы белковых токсинов. Для человека средняя смертельная доза рицина составляет 0,3 мг/кг перорально, или примерно 1,78 мг для взрослого. Однако токсичность вещества зависит от пути воздействия. При ингаляционном пути попадания в организм человека токсическое воздействие больше, чем при пероральном введении. Средняя летальная доза вещества (LD5₀) при ингаляции составляет 3—5 мкг/кг, в то время как пероральная LD₅₀ составляет 20 мг/кг. При инъекционном пути введения за счет высокой биодоступности отравление возможно при меньших дозах. Смертельной для человека является доза 4—8 семян клещевины.

Первичные симптомы отравления: поражение слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, тошнота, рвота, диарея, часто с кровью, кишечные колики, геморрагии, в том числе на сетчатке глаза, синюшность, коллапс (резкое падение кровяного давления), судороги. При контакте порошка рицина со слизистой оболочкой возможны появление жжения, покраснения, боль, отеки, слезотечение и резь в глазах.

Рицин считается одним из самых токсичных веществ. При этом он более прост в производстве, чем другие биологические агенты, и для его выделения требуются лишь знания базовых методов, используемых в химии и фармации. Он может быть использован в качестве потенциального инструмента при биотеррористических атаках. Таким образом, особый интерес представляет разработка методики обнаружения рицина в биологических объектах при отравлении [1].

В клинической лабораторной диагностике при исследовании биологических объектов на наличие токсических веществ применяются современные инструментальные методы, в том числе высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) [5, 6]. ВЭЖХ-МС/МС. Данный метод широко используется в качестве подтверждающего при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании [7, 8], в том числе для обнаружения метаболитов исследуемых веществ [9, 10].

При определении токсических веществ в биологических объектах важную роль играют метаболиты и метаболизм в целом [11, 12]. Время пребывания несвязанной формы рицина в крови не превышает нескольких минут. Токсикант разрушается при участии протеолитических ферментов [13]. Токсический алкалоид рицинин, небольшие количества которого содержатся в касторовых бобах, экстрагируется совместно с рицином. Случаев отравления людей только рицинином не описано, возможно, из-за невозможности его обнаружить [14]. В качестве маркера отравления рицином могут использоваться рицинин и рицинолевая кислота. Рицинин присутствует в следовых количествах практически во всех препаратах рицина, но менее, чем рицин, подвержен метаболизму. Его определение в моче возможно даже спустя 2 сут после экспонирования экспериментального животного к рицину [15]. Рицинолевую кислоту также легче обнаружить, чем рицин, благодаря ее высокому процентному содержанию в масле. Таким образом, обнаружение в биологических объектах рицинина и рицинолевой кислоты в качестве маркера отравления рицином является актуальной задачей при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследования.

Цель исследования — разработать методику определения маркеров рицина в биологических жидкостях при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследования.

В качестве объекта сравнения использовали экстракт семян клещевины обыкновенной (Ricinus commúnis), содержащей рицин, рицинин и рицинолевую кислоту.

Объектом исследования служили кровь и моча человека как основные биологические объекты при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа при отравлении [16, 17].

Анализ проводили методом масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией на хромато-масс-спектрометре Orbitrap Exploris 120. Хроматограммы были получены в режиме, включающем полное сканирование и фрагментацию ионов (FullMS-ddMS2), который обеспечивает получение информации о молекулярном ионе предполагаемого метаболита и его характеристичных фрагментах.

Детектирование осуществляли в режиме информационно зависимого сканирования в диапазоне масс 50—750 Da. Применяли аналитическую колонку Accucore Phenyl Hexyl (2,1×100 мм; 2,6 мкм) с термостатированием 30 °C. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин. Состав подвижной фазы: Фаза A — 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде; Фаза B — 100% ацетонитрил для хроматографии. Объем вводимой пробы задавали 10 мкл. Общее время анализа — 15,5 мин. Условия градиентного режима подачи элюента приведены в табл. 1.

Таблица 1. Программа градиентного элюирования

В пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл помещали 200 мкл крови, 300 мкл метанола, интенсивно встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин, метанольное извлечение упаривали, сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Переносили 100 мкл органической фазы в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

1. Для проведения скрининга методом ВЭЖХ МС/МС в пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл помещали 200 мкл мочи, 300 мкл метанола, интенсивно встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин, метанольное извлечение упаривали, сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Затем 100 мкл органической фазы переносили в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

2. Для проведения исследования методом ВЭЖХ МС/МС после щелочного гидролиза во флакон объемом 9 мл помещали 2 мл мочи, добавляли 0,5 мл 5Н раствора NaOH, выдерживали при 50 °C в течение 20 мин. Охлаждали при комнатной температуре. Гидролизат подкисляли до значения pH=2—3 добавлением 250—350 мкл концентрированной хлористоводородной кислоты, затем охлаждали. Экстрагирование проводили двукратно по 3 мл смесью гексан—этилацетат (7:1), далее центрифугировали (3 мин при 3000 об/мин). Верхний органический слой отбирали и упаривали. Сухой остаток извлечения с помощью этилацетата количественно переносили в виалу емкостью 1,5 мл, растворитель упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Органическую фазу объемом 100 мкл переносили в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

3. Для проведения исследования методом ВЭЖХ МС/МС после кислотного гидролиза во флакон объемом 16 мл добавляли 2 мл мочи и 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, гидролизовали в герметично закрытом флаконе в течение часа на водяной бане при температуре 100 °C. Охлажденный гидролизат фильтровали через бумажный фильтр, фильтр промывали 1 мл 18% хлористоводородной кислоты.

3.1. Водную фазу экстрагировали двукратно по 3 мл диэтиловым эфиром, органические фазы объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия и выпаривали. Сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Затем 100 мкл органической фазы переносили в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

3.2. Далее к водной фазе добавляли 1 мл 60% раствора гидроксида натрия до значения pH=10—11 по универсальному индикатору, раствор охлаждали, добавляли 1 г кристаллического гидрокарбоната натрия до насыщения раствора, дважды экстрагировали 3 мл смеси метиленхлорид—гептан—изопропанол (7:2:1), извлечения объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия и упаривали. Сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Переносили 100 мкл органической фазы в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

4. Для проведения скрининга методом ВЭЖХ МС/МС во флакон объемом 9 мл добавляли 2 мл мочи, подкисляли 10% раствором хлористоводородной кислоты до значения pH среды 2 по универсальному индикатору и трижды экстрагировали хлороформом порциями по 10 мл. Извлечения объединяли, фильтровали, упаривали до 1 мл. Водную фазу подщелачивали раствором аммиака до значения pH среды 10 по универсальному индикатору, трижды экстрагировали хлороформом порциями по 10 мл, фильтровали, упаривали до 1 мл.

По 1 мл кислого и щелочного извлечения упаривали. Сухой остаток растворяли в 200 мкл смеси (0,1% раствор муравьиной кислоты в 10% водном растворе ацетонитрила), встряхивали на вортекс-миксере в течение 30 с, центрифугировали при 14 000 об/мин. Переносили 100 мкл органической фазы в виалу объемом 1,5 мл со вставкой для хроматографирования.

Ввиду отсутствия стандартного образца рицина его хроматографические данные получали при исследовании извлечения из семян клещевины. Несколько семян растирали и гомогенизировали, добавляли подкисленную щавелевой кислотой воду и оставляли отстаиваться 1—2 ч. Затем центрифугировали при 14 000 об/мин и экстрагировали диэтиловым эфиров. Раствор подщелачивали раствором аммиака.

Одновременное обнаружение в исследованных биологических жидкостях (кровь и моча) рицинина и рицинолевой кислоты позволяет предположить отравление человека семенами клещевины.

Результаты исследования (рис. 1—3) дают возможность описать хроматографические и масс-спектрометрические характеристики определения рицинина и рицинолевой кислоты в биологических жидкостях (табл. 2).

Рис. 1. Хроматограмма рицинина (а) и рицинолевой кислоты (б) в извлечении из семян клещевины.

Рис. 2. Хроматограмма рицинина (а) и рицинолевой кислоты (б) в извлечении из крови.

Рис.3. Хроматограмма рицинина (а) и рицинолевой кислоты (б) в извлечении из мочи.

Таблица 2. Хроматографические и масс-спектрометрические характеристики рицинина и рицинолевой кислоты

Данные табл. 2 позволяют проводить идентификацию рицинина и рицинолевой кислоты для подтверждения факта отравления рицином.

1. Определены оптимальные условия пробоподготовки биологических жидкостей, позволяющие экстрагировать компоненты семян клещевины (рицинин и рицинолевая кислота).

2. Разработана экспресс-методика обнаружения маркеров рицина (рицинин и рицинолевая кислота) методом масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией.

3. Описаны хроматографические и масс-спектрометрические характеристики для достоверной идентификации рицинина и рицинолевой кислоты как маркеров отравления рицином при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.