В последние годы растет число синтетических психоактивных соединений. Это осложняет работу рутинных химико-токсикологических лабораторий, в которых исследуют биологические образцы, взятые от пациентов в состоянии интоксикации или в рамках проводимых медицинских освидетельствований на состояние опьянения.

Вновь появляющиеся психоактивные вещества практически не изучены: неизвестны клинические признаки интоксикации, пути метаболизма в организме человека, их фармакокинетические и фармакодинамические свойства. Большинство этих соединений нельзя обнаружить с помощью иммунохроматографических тестов, поэтому каждое химико-токсикологическое исследование становится ненаправленным и выполняется с применением хромато-масс-спектрометрического оборудования. Рутинный химико-токсикологический анализ стал в 2—3 раза более продолжительным по времени. В этих условиях актуальна задача разработки таких методов пробоподготовки и анализа, которые помогут не только повысить информативность химико-токсикологического исследования, но и увеличить пропускную способность лаборатории.

— провести сравнительную оценку изолирования методами ЖЖЭ и ТФЭ наркотических, психотропных веществ и их метаболитов из мочи для исследования методами ГХМС и ВЭЖХ—МС/МС;

— апробировать процедуры подготовки проб для ГХМС и ВЭЖХ—МС/МС в ненаправленном химико-токсикологическом исследовании реальных образцов мочи.

Для сравнительных испытаний использовали усредненные пробы мочи, содержащие наркотические и психотропные вещества и их метаболиты. В образцах, маркированных PT-8-urine и PT-9-urine, объединили пробы мочи, в которых при проведении химико-токсикологических исследований выявлялись метаболиты/маркеры употребления наркотических средств и психотропных веществ. До проведения исследования образцы хранились при температуре –20 °C.

Для апробации предлагаемых процедур пробоподготовки ретроспективно проанализировали образцы мочи пациентов, госпитализированных в Нижневартовскую психоневрологическую больницу в состоянии интоксикации после сочетанного употребления разных психоактивных соединений в октябре 2015 г. (проба Nv-42-urine) и в феврале 2016 г. (проба Nv-78-urine). У госпитализированных отмечали психоневрологические и соматические нарушения, по всей вероятности, вызванные сочетанным воздействием наркотических средств и их метаболитов. Образцы брали в течение первых 2 ч после госпитализации. До проведения ретроспективного исследования образцы хранили при температуре –20 °С.

Процедура ЖЖЭ. 3 мл мочи подвергали минеральному гидролизу с 200 мкл 10Н КОН 30 мин при температуре 50 °C. Экстрагировали 1,5 мл смеси дихлорметан/гептан/изопропанол в соотношении 6:3:1 при рН 8,0—9,0. После центрифугирования верхний органический слой переносили в емкость для упаривания. Водную фазу вновь подкисляли до рН 2,0—3,0 и экстрагировали 1,5 мл смеси гептан/этилацетат в соотношении 7:1. После центрифугирования верхний органический слой объединяли с предыдущим экстрактом и упаривали в вакуумном экстракторе при температуре 45 °C. Для ВЭЖХ—МС/МС сухой экстракт растворяли в 400 мкл ацетонитрила. Для ГХМС проводили дериватизацию с 50 мкл 1% ТМХС в БСТФА и 50 мкл этилацетата в течение 30 мин при температуре 100 °C. Финальный объем доводили до 200 мкл этилацетатом [1].

Процедура ТФЭ. Патрон для ТФЭ (SampliQ Evidex, 200 мг, 3 мл) предварительно концентрировали последовательным пропусканием 1 мл метанола, 2 мл воды и 2 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,0. Затем 3 мл мочи подвергали минеральному гидролизу с 200 мкл 10Н КОН в течение 30 мин при температуре 50 °C. Доводили значение рН до 6,0—7,0 концентрированной НСl и добавляли 3 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,0. После центрифугирования супернатант загружали в патрон для ТФЭ со скоростью 1—2 мл/мин. Промывали патрон последовательным пропусканием 3 мл воды и 2 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,0. После вакуумного подсушивания в течение 1 мин патрон промывали 0,5 мл метанола и продолжали подсушивать еще в течение 5 мин. Элюирование проводили 2 мл смеси дихлорметан/аммиак концентрированный в соотношении 98:2. Упаривали в вакуумном экстракторе при температуре 45 °C. Для ВЭЖХ—МС/МС сухой экстракт растворяли в 400 мкл ацетонитрила, а для ГХМС проводили дериватизацию с 50 мкл 1% ТМХС в БСТФА и 50 мкл этилацетата 30 мин при температуре 100 °C. Финальный объем доводили до 200 мкл этилацетатом.

Процедура ПВ 4:1 для ВЭЖХ—МС/МС. 400 мкл мочи и 100 мкл ацетонитрила перемешивали 10 с и центрифугировали в течение 10 мин при 15 000 об/мин. Затем 400 мкл супернатанта переносили в виалу для хроматографирования.

Процедура ПВ 1:1 для ВЭЖХ—МС/МС. 250 мкл мочи и 250 мкл ацетонитрила перемешивали 10 с и центрифугировали в течение 10 мин при 15 000 об/мин. Затем 400 мкл супернатанта переносили в виалу для хроматографирования.

Метод ГХМС. Анализатор — Agilent 7890A/5975C с кварцевой капиллярной колонкой Rxi-5ms длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, толщиной пленки нанесенной неподвижной фазы (5%-фенил)-полиметилсилоксана 0,25 мкм. Анализ в режиме постоянного потока газа-носителя гелия 1,2мл/мин. Объем вводимого образца 1 мкл, без разделения потока. Температура инжектора 280 °C, интерфейса 280 °C. Программа термостатирования колонки: 1 мин при температуре 100 °C, увеличение температуры до 290 °C со скоростью 25 °C в 1 мин, 7 мин при температуре 290 °C. Режим сканирования по полному ионному току (SCAN). Температура источника ионов 230 °C, температура анализатора 150 °C. Диапазон масс m/z 41—650 а.е.м. Идентификацию целевых соединений выполняли с помощью программ AMDIS и MSD ChemStation с использованием библиотек масс-спектров MWP2011, NIST11, Wiley 9, SUDMED_2288_AMDISLIB/NISTLIB/ACSLIB_20160314 [1—3].

Метод ВЭЖХ—МС/МС. Применялся метод, представленный в информационном письме ННЦ наркологии Минздрава России в 2014 г. [4].

Целевые соединения — наркотические средства, психотропные вещества и их метаболиты в образцах мочи PT-8-urine и PT-9-urine ранее определены по результатам 2-го раунда многоцентровых сличительных испытаний МежтоксЛаб в 2016 г. [5].

В образце PT-8-urine обнаружили вещества и/или метаболиты веществ: амфетамин, MDPV, aPVP, кодеин, морфин, THC-СООН, PB-22 °F, XLR11, AB-CHMINACA, в образце PT-9-urine — вещества и/или метаболиты веществ: MDPV, aPVP, 5F-AB-PINACA, AB-CHMINACA, XLR11, MDMB (N)-bz-F (табл. 1).

Целевые соединения наркотические средства, психотропные вещества и их метаболиты в образцах мочи Nv-42-urine и Nv-78-urine ранее определены по результатам химико-токсикологических исследований методами, представленными в информационных письмах ННЦ наркологии [3, 4], в день госпитализации пациентов.

В образце Nv-42-urine обнаружили вещества и/или метаболиты веществ: aPVP, кодеин, морфин, AB-CHMINACA, в образце Nv-78-urine – обнаружены вещества и/или метаболиты веществ: aPVP, 5F-AB-PINACA, MDMB (N)-2201 (табл. 2).

Для изолирования и концентрирования целевых соединений протестировали два метода: ЖЖЭ при рН 8,0—9,0 и при рН 2,0—3,0 после щелочного гидролиза и ТФЭ при рН 6,0—7,0 после щелочного гидролиза. Как видно из данных табл. 1 и 2, более эффективным методом изолирования и концентрирования из мочи наркотических средств, психотропных веществ и их метаболитов при химико-токсикологическом скрининге можно считать ТФЭ.

Провели сравнительную оценку процедур ЖЖЭ, ТФЭ и ПВ для ВЭЖХ—МС/МС. Установили, что несомненным преимуществом прямого ввода образца для метода ВЭЖХ—МС/МС является возможность выявления и идентификации глюкуронидов целевых соединений (в том числе этилглюкуронида). Способы подготовки проб без концентрирования позволили выявить методом ВЭЖХ—МС/МС лишь часть каннабимиметиков, присутствовавших в образцах (см. табл. 1, 2). Очевидно, несмотря на привлекательность данного способа пробоподготовки, для определения продуктов метаболизма синтетических каннабимиметиков и тетрагидроканнабинола необходимы процедуры изолирования после предшествующего гидролиза и концентрирования.

Психостимуляторы aPVP и MDPV выявляли независимо от способа пробоподготовки и инструментального метода. Методы изолирования и концентрирования не имеют никакого преимущества в интенсивности отклика соединений на хроматограмме по сравнению с методом прямого ПВ (см. табл. 1, 2).

1. Для идентификации маркеров наркотических средств и психоактивных веществ в моче методом ГХМС более эффективна (в 1,5—2 раза) процедура пробоподготовки ТФЭ, чем ЖЖЭ. Для исследования методом ВЭЖХ—МС/МС эффективность процедур пробоподготовки ЖЖЭ и ТФЭ практически равнозначна.

2. Преимущество процедур ПВ 4:1 и ПВ 1:1 для метода ВЭЖХ—МС/МС состоит в возможности определения глюкуронидов целевых соединений. Нецелесообразно применять только этот метод при проведении скринингового химико-токсикологического исследования, так как он позволяет выявить методом ВЭЖХ—МС/МС часть маркеров каннабимиметиков, присутствующих в образцах мочи (в данном эксперименте 11 из 15 целевых аналитов).

3. Сочетание ГХМС с процедурой пробоподготовки ТФЭ и одновременно ВЭЖХ—МС/МС с процедурой пробоподготовки ПВ 4:1 позволяет в 1,5 раза повысить выявляемость целевых соединений при проведении ненаправленного химико-токсикологического исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.