Оптимизация условий определения психоактивных веществ группы холиноблокаторов и антидепрессантов методом микроколоночной ВЭЖХ

В настоящее время в Российской Федерации наблюдается рост злоупотребления различными психоактивными веществами, которые можно беспрепятственно приобрести в аптечной сети — так называемыми аптечными наркотиками.

Многие экспертные учреждения испытывают трудности при определении подобных веществ не только вследствие отсутствия методик анализа, но и главным образом из-за отсутствия стандартных образцов сравнения. Данную проблему позволяет решить хроматография в сочетании с масс-детектированием (ГЖХ/МС). По сравнению с другими методами надежность идентификации методом хроматомасс-спектрометрии значительно выше вследствие использования специфической характеристики вещества — масс-спектра [1], однако и здесь существуют определенные затруднения. Во-первых, при использовании ГЖХ/МС требуется дополнительная пробоподготовка путем дериватизации, так как у исследуемых веществ низкая летучесть. Во-вторых, стоимость подобных приборов очень высока.

Избежать этих трудностей можно, используя для анализа жидкостный микроколоночный хроматограф Милихром А-02 с УФ-детектором (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», Новосибирск). Несомненными достоинствами данного прибора по сравнению со стандартными хроматографами являются простота в эксплуатации, низкая стоимость, высокая надежность, десятикратно меньший расход элюента и сорбента для колонок. Кроме того, Милихром А-02 оснащен базой хроматографических и спектральных данных БД-2003 (ЗАО ИХ «ЭкоНова», Новосибирск), которая позволяет автоматически идентифицировать аналит по объему удерживания (VR, мкл) и спектральным отношениям.

Идентификация веществ по базе данных (БД) возможна только в случае использования одной и той же хроматографической системы: колонка диаметром 2 мм, длиной 75 мм с обращенно-фазовым сорбентом ProntoSIL 120−5 С18, фиксированный градиентный режим элюирования, многоволновая УФ-детекция. Необходимо также придерживаться определенного состава подвижной фазы: «элюент А» — [4 М LiClO4 – 0,1 M HClO4]: H2O (5:95); «элюент Б» — ацетонитрил.

Эти условия можно считать универсальными: градиентный режим позволяет работать с веществами, значительно отличающимися по гидрофобности; присутствие в подвижной фазе кислоты обеспечивает удержание органических кислот, а высокая концентрация перхлорат-ионов способствует удержанию соединений основного характера и улучшает форму их пиков. Используемые 8 длин волн детектирования вполне достаточно характеризуют спектры веществ в наиболее информативной области УФ-диапазона [2].

Цель исследования — модификация унифицированных условий БД-2003 для определения ряда лекарственных препаратов из групп холиноблокаторов и антидепрессантов на приборном комплексе Милихром А-02.

Унифицированные условия хроматографического определения применяли для разделения и обнаружения ряда лекарственных препаратов из группы антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) в экспертных исследованиях (табл. 1). Антидепрессанты с различными химической структурой и механизмом действия могут стать источниками отравлений, в том числе комбинированных, а также объектами злоупотребления [3, 4].

Результаты исследований представлены в табл. 2 и на рис. 1. При использовании условий БД-2003 на хроматографе Милихром А-02 наблюдается эффективное разделение всех анализируемых антидепрессантов.

Безусловное преимущество условий БД — возможность идентификации широкого круга (около 500) наркотических и лекарственных средств. Длительность анализа (42 мин) может служить некоторым препятствием для применения методики в рутинном анализе при большом количестве проб.

Альтернативой разработанным условиям может быть подбор соотношения элюентов для конкретного вещества или группы веществ для использования при направленном анализе. Взяв за основу методику БД и подбирая оптимальные условия элюирования, можно добиться эффективного разделения компонентов смеси при относительно небольшой длительности анализа. Подобное решение осуществили при разработке методик анализа некоторых холинолитических средств, поглощающих в УФ-излучении.

Лекарственные средства из группы холиноблокаторов широко применяются в медицинской практике. В терапевтических дозах препараты оказывают слабое влияние на ЦНС, однако при употреблении высоких доз возможно развитие «холинолитического синдрома»: двигательное и психическое возбуждение, беспокойство, галлюцинации и др. [5]. Немедицинское использование данной группы веществ связано с их способностью изменять человеческое восприятие, вызывать зрительные галлюцинации и необычные «телесные ощущения». Среди подростков, экспериментирующих с различными психоактивными веществам, наиболее популярны холинолитические препараты триган Д (дицикловерин), тропикамид (тропикамид) и цикломед (циклопентолат) (табл. 3).

Объектом анализа служили стандартные растворы исследуемых веществ с концентрацией 50 мкг/мл в метаноле. Растворы хроматографировали в изократическом режиме с использованием элюентов на основе ацетонитрила и перхлоратного буфера в соотношениях 30:70; 60:40; 50:50; 70:30 со скоростью потока 100 и 150 мкл/мин.

Получили асимметричные пики исследуемых веществ с малым временем удержания. В подобных условиях хроматографическая система не может быть применена для практических целей, поскольку высока вероятность наложения пиков соэкстрактивных гидрофильных веществ биообъектов на пик анализируемого соединения.

Следующим этапом стало определение возможности использования для анализа исследуемых веществ градиентного режима элюирования. Градиентное элюирование незаменимо при анализе сложных многокомпонентных систем, каковыми являются извлечения из биологических объектов. Данный режим обеспечивает более полное и качественное разделение компонентов, чем изократический режим.

Исследовали следующие схемы градиента при использовании элюента на основе ацетонитрила и перхлоратного буфера: градиент от 5 до 70% ацетонитрила за 15 мин; от 5 до 60% ацетонитрила за 10 мин; от 10 до 70% ацетонитрила за 10 мин; от 10 до 85% ацетонитрила за 10 мин; от 20 до 100% ацетонитрила за 15 мин; от 20 до 100% ацетонитрила за 10 мин; от 30 до 100% ацетонитрила за 10 мин; от 30 до 80% ацетонитрила за 15 мин; от 30 до 80% ацетонитрила за 10 мин.

Установили, что оптимальной для хроматографирования тропикамида является схема градиента от 10 до 85% ацетонитрила за 10 мин. Пик имеет правильную симметричную форму, время удержания составляет 8,15 мин (рис. 2).

На основе полученных данных в качестве оптимальных выбрали следующие условия элюирования циклопентолата: градиент от 30 до 100% ацетонитрила за 10 мин. В качестве параметра идентификации использовали время удерживания 6,40 мин (см. рис. 2). Поскольку детекцию проводили на 8 длинах волн, поэтому для более надежной идентификации использовали спектральные соотношения (табл. 4).

Показана возможность использования условий БД-2003 для разделения многокомпонентных смесей антидепрессантов, а также возможность модификации унифицированных условий для определения веществ, имеющих токсикологическое значение.