В последние годы зубная биопленка представляет собой объект активных исследований, поскольку не только вовлечена в развитие кариеса, хронических и острых инфекции [1—4], но и участвует в обменных процессах, протекающих в ротовой полости [5—8]. Условия данных физико-химических процессов зависят от состава и свойств зубной биопленки [5, 7, 9—11], которая включает в себя различные органические вещества и минеральные ионы, бактерии и воду [3, 5, 10, 12, 13].
Следует отметить, что биопленка напрямую и опосредовано контактирует с ротовой жидкостью, в которой содержатся необходимые для реминерализации эмали ионы и комплексы [8, 14]. Внесение в ротовую полость и последующее накопление в биопленке ряда веществ, способных образовывать химически стабильные соединения в поверхностном слое эмали, являются задачами реминерализующей терапии и могут быть выполнены методами экзо- и эндогенной профилактики [8, 15—17].
В наших предыдущих работах было продемонстрировано, что экзо- и эндогенные методы профилактики по-разному влияют на молекулярный состав и органоминеральный баланс ротовой жидкости [18, 19]. При этом эндогенные методы профилактики приводят к долговременному присутствию в ротовой жидкости необходимых для реминерализации эмали минералов и органоминеральных групп и комплексов, что является предпосылкой для их возросшей концентрации в биопленке, а следовательно, на поверхности эмали [19]. При этом понятно, что эффективное управление процессами минерализации твердой ткани требует изучения и новых стратегий идентификации и контроля молекулярного состава зубной биопленки.
Наиболее удобным и востребованным подходом для этого является инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) [18, 20—22]. Однако, к сожалению, в огромной совокупности уже имеющихся данных нет информации, полученной методами FTIR, об особенностях молекулярного состава зубной биопленки человеческих зубов у пациентов в норме и при развитии кариозных патологий, а также о происходящих в биопленке изменениях при использовании различных профилактических средств.
Цель нашего исследования — изучение особенностей молекулярного состава зубной биопленки на этапах экзо- и эндогенной профилактики у лиц с различной кариесогенной ситуацией с привлечением методов синхротронной инфракрасной (ИК) молекулярной спектроскопии.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 100 человек (50 мужчин и 50 женщин) европеоидной расы в возрасте 18—25 лет, физически здоровые, без вредных привычек и с различным типом кариесогенной ситуации в ротовой полости. У участников первой (здоровой) группы (25 мужчин и 25 женщин) не было клинически различимых кариозных поражений зубной ткани. Участники второй (кариозной) группы (25 мужчин и 25 женщин) имели зубы с поверхностным кариесом эмали (индекс ICDAS 1—2 [23]). При этом у всех участников эксперимента не было выявлено признаков развития пародонтита или гингивита.
Во время проведения эксперимента и за 1 нед до его начала пациенты питались в основном пищей растительного происхождения, вели стандартный водный режим, не принимали лекарственные препараты, не употребляли алкоголь.
У всех участников исследования в ходе эксперимента были взяты образцы биопленки с поверхности зубов. Биопленка аккуратно снималась с поверхности центральных резцов верхней челюсти с использованием стерильного скальпеля, не касаясь десневой борозды.
Регламент получения образцов зубной биопленки в нашем исследовании был следующий. На I этапе образцы биопленки были взяты у участников исследования на 8-й день после начала наблюдений без изменения условий гигиены ротовой полости. Забор происходил в утреннее время до гигиены полости рта с использованием зубной пасты, а также приема пищи. Через 30 мин после механической очистки зубов с помощью мягкой зубной щетки в течение 3 мин (для удаления остатков зубной бляшки с поверхности зубов) и предварительного полоскания ротовой полости чистой водой биопленка была взята у двух групп участников исследования в первый раз.
На II этапе эксперимента (на следующий день) пациенты использовали для чистки зубов зубную пасту с глицерофосфатом кальция [24, 25]. Через 30 мин после гигиены полости рта и полоскания ротовой полости чистой водой биопленка была взята у двух групп участников исследования во второй раз.
На следующий день после приема пищи пациенты стали принимать таблетки, содержащие минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция [24, 25]. Пациенты принимали по одной таблетке 3 раза в день. На 4-й день утром до приема пищи, через 30 мин после механической очистки зубов с помощью мягкой зубной щетки в течение 3 мин (для удаления остатков зубной бляшки с поверхности зубов) и предварительного полоскания ротовой полости чистой водой биопленка была взята у двух групп участников исследования в третий раз (III этап).
После забора образцы биопленки хранились при температуре 4 °C.
Исследования молекулярного состава биопленок были выполнены с привлечением оборудования лаборатории ИК микроспектроскопии (IRM) (Австралийский синхротрон, Виктория, Австралия) с использованием спектрометра Bruker Vertex 80v, совмещенного с FTIR-микроскопом Hyperion 2000 и охлаждаемым жидким азотом узкополосным детектором («Bruker Optik GmbH», Эттлинген, Германия).
Описательные статистики в группах выполнены с использованием стандартного t-теста и приведены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ межгрупповых различий участников эксперимента проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа ANOVA на основе одностороннего критерия Краскела—Уоллиса. Используя тест множественных сравнений Данкана, определяли значимость влияния типа используемой профилактики для конкретной подгруппы участников эксперимента (внутригрупповые различия).
Результаты и обсуждение
На рис. 1 и 2 представлены ИК-спектры поглощения образцов зубной биопленки, собранные у двух групп участников эксперимента с различной кариесогенной ситуацией на различных этапах исследования. Спектры получены с использованием приставки высокого давления с алмазной призмой к ИК-микроскопу [26] и синхротронного излучения [27, 28]. Предварительное рассмотрение полученных результатов показало, что для конкретного этапа эксперимента в спектрах двух групп участников исследования содержится один и тот же набор колебательных мод, отвечающих характеристическим молекулярным связям. При этом спектры в конкретной выборке незначительно отличаются друг от друга по интенсивности, что обусловлено индивидуальными особенностями участников эксперимента. Учитывая данный факт, на рис. 1 и 2 представлены усредненные ИК-спектры поглощения зубной биопленки до проведения профилактики (этап I), после использования зубной пасты (этап II) и после использования минерального комплекса на основе глицерофосфата кальция (этап III).
Рис. 1. ИК-спектры поглощения образцов зубной биопленки здоровой группы на различных этапах исследования.
Рис. 2. ИК-спектры поглощения образцов зубной биопленки кариозной группы на различных этапах исследования.
Анализ полученных спектров, проведенный на основе известных работ, в которых методом ИК-спектроскопии исследовались биологические жидкости ротовой полости, биопленки, твердые ткани человеческого зуба, а также фосфаты, имеющие отношение к образованию эмали и дентина [20, 21, 29—33], показал, что экспериментальные ИК-спектры биопленок имеют типичный набор основных колебаний.
На рис. 1 и 2 вместе со спектрами образцов зубной биопленки мы приводим ИК-спектр поглощения использованной на II этапе эксперимента зубной пасты с глицерофосфатом кальция и использованной на III этапе эксперимента таблетки, содержащей минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция. Сопоставление спектров использованных профилактических средств со спектрами зубной биопленки показывает, что в ИК-спектрах биопленки на соответствующих этапах эксперимента присутствуют специфические группы колебаний, характерные для ИК-спектров поглощения профилактических средств. Это связано с наличием в составе профилактических средств различных органоминеральных комплексов, молекулярный состав которых близок к молекулярному составу органоминерального комплекса биопленок. Из этого можно сделать предварительное заключение о том, что использование на соответствующем этапе эксперимента профилактических средств может повлиять на молекулярный состав биопленки [8, 25], что в свою очередь отражается на спектроскопических характеристиках.
В ряде наших предыдущих работ было показано [18, 19], что изучить особенности изменений, происходящих в молекулярном составе биологических жидкостей ротовой полости, в том числе при развитии патологий, а также дать математическую оценку этим изменениям можно на основе расчета и анализа соотношений (коэффициентов) между органическими и минеральными составляющими образца биопленки. Следуя логике наших предыдущих работ, мы рассчитали несколько таких соотношений, однако далее опишем лишь те из них, на которые следует обратить внимание, поскольку, на наш взгляд, они отражают суть происходящих в молекулярном составе зубной биопленки изменений.
Первое соотношение R1 — минерал-органическое соотношение (фосфат/протеин/липид). Этот коэффициент рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы, соотносимой с минеральной составляющей и производных фосфатов, к суммарной интегральной интенсивности полосы Amid I и интегральной интенсивности полосы колебаний CH2/CH3 связей (липиды).
Второе соотношение R2 — фосфат/минеральное, может быть рассчитано из отношения суммарной интегральной интенсивности полосы колебаний PO−2, ассоциированной с фосфатными остатками и фосфолипидами, и колебаний глицерофосфатов к интегральной интенсивности полосы, соотносимой с минеральной составляющей.
Третье соотношение R3 — фосфолипид/липидное. Оно может быть рассчитано из соотношения интегральной интенсивности колебаний CH2 и CH3 групп фосфолипидов и жирных кислот к интегральной интенсивности CH2 и CH3 связей липидов.
Результаты расчетов соотношений R1—R3 представлены на рис. 3 и 4.
Рис. 3. Bar-chart диаграммы изменений соотношений R1—R3 на различных этапах эксперимента у здоровой группы.
Рис. 4. Bar-chart диаграммы изменений соотношений R1—R3 на различных этапах эксперимента у кариозной группы.
Для установления влияния используемого типа профилактики (экзо-/эндо-) на молекулярный состав биопленки конкретной группы участников эксперимента были определены значимые внутригрупповые различия между соотношениями R1—R3. Для этого на основе теста множественных сравнений Данкана в конкретной группе участников эксперимента относительно этапа I (без профилактики) мы сравнили значения соотношений R1—R3 при использовании зубной пасты и таблеток с глицерофосфатом кальция. Выявленные статистически значимые внутригрупповые различия на уровне значимости p<0,05 отражены в табл. 1.
Таблица 1. Внутригрупповые различия для соотношений R1—R3 в зависимости от типа профилактики по отношению к начальной стадии
| Группа участников | Виды профилактики | Соотношения | ||
| R1 | R2 | R3 | ||
| Здоровая | Паста | + | — | + |
| Таблетка | + | — | + | |
| Кариозная | Паста | — | — | + |
| Таблетка | + | + | + | |
Статистически значимые межгрупповые различия для соотношений R1—R3 были определены на основе результатов дисперсионного анализа. Мы попарно сравнили значения R1—R3 коэффициентов в здоровой и кариозной группах. Наличие статистически значимых различий на уровне значимости p<0,05 отражено в табл. 2.
Таблица 2. Межгрупповые различия в соотношениях R1—R3 между здоровой и кариозной группами участников эксперимента в зависимости от типа профилактики
| Этап эксперимента (стадия профилактики) | Соотношения | ||
| R1 | R2 | R3 | |
| II (Паста) | + | — | — |
| III (Таблетка) | + | + | + |
На основе результатов, полученных методом синхротронной FTIR, расчетов соотношений между органической и минеральной составляющими, а также статистического анализа данных, мы смогли оценить изменения, происходящие в молекулярном составе зубной биопленки на этапах экзо- и эндогенной профилактики для двух групп участников исследования (здоровой и кариозной).
Анализируя полученные результаты, можно заметить, что использование профилактических средств по-разному отражается на молекулярном составе зубной биопленки у пациентов с различной кариесогенной ситуацией. Как видно из полученных данных (см. рис. 1, 2), использование профилактических средств (зубной пасты и таблеток) у пациентов здоровой (контрольной) группы приводит к значительному увеличению фосфат/протеин/липид-соотношения в образцах биопленки относительно аналогичной величины для I этапа эксперимента (без использования профилактических средств). В то же время для кариозной группы участников исследования R1-соотношение практически не меняется при использовании зубной пасты и даже уменьшается на этапе применения минерального комплекса, содержащего глицерофасфат кальция.
Применение профилактических средств не отражается на величине фосфат/минерального соотношения у пациентов здоровой группы, однако у участников исследования, имеющих поверхностный кариес, R2-соотношение возрастает по мере роста стадии без использования профилактических средств.
Что же касается фосфолипид/липидного соотношения, то у пациентов здоровой группы при использовании зубной пасты и таблеток, содержащих минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция, наблюдается значительный рост R3-соотношения относительно I этапа (без использования профилактических средств), при этом использование таблеток приводит к практически десятикратному увеличению этого соотношения. Говоря о пациентах кариозной подгруппы, можно отметить, что R3-соотношение также возрастает при использовании профилактических средств, хотя и не так сильно, как для здоровой группы. При этом более значительный рост R3-соотношения относительно начальной стадии эксперимента зафиксирован при использовании зубной пасты, чем таблеток, содержащих минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция.
У здоровой группы участников различия значимы для фосфат/протеин/липидного R1-соотношения и фосфолипид/липидного R3-соотношения при использовании как пасты, так и таблеток. У участников кариозной группы различия наблюдаются для R3-соотношения только при использовании зубной пасты, а при использовании таблеток — для всех трех соотношений.
Анализируя данные дисперсионного анализа, можно уверенно сказать, что статистически значимые межгрупповые различия между здоровой и кариозной группами (см. табл. 2) наблюдаются для фосфат/протеин/липидного соотношения при использовании как зубной пасты, так и таблеток. Для фосфат/минерального и фосфолипид-липидного соотношений значимые межгрупповые различия между здоровой и кариозной группами наблюдаются только на этапе использования таблеток минерально-витаминного комплекса. В то время как при использовании зубной пасты значимых межгрупповых различий для соотношений R2 и R3 не наблюдалось.
Понять происходящие изменения в соотношениях R1—R3 между органической и минеральной составляющими, а также значимость этих изменений с учетом стадии профилактики и кариесогенной ситуации у пациентов можно, принимая в учет данные нашей предыдущей работы [19, 26], посвященной использованию экзо- и эндогенных методов профилактики для насыщения ротовой жидкости ионами, необходимыми для реминерализации.
Как было показано, гигиена полости рта с применением зубной пасты, содержащей глицерофосфат кальция, кратковременно насыщает ротовую жидкость фосфатами. При этом использование таблеток, содержащих минеральный комплекс с глицерофосфатом кальция, приводило к долговременному присутствию в ротовой жидкости минеральных групп и комплексов. Исходя из этих данных становится понятно, что увеличение фосфат/протеин/липидного соотношения в образцах биопленки контрольной (здоровой) группы пациентов при использовании профилактических средств связано как с насыщением биопленки минеральными комплексами, так и с состоянием микробиоты. Более высокая концентрация фосфата в биопленке указывает на более высокий потенциал для предотвращения кислотных атак [34].
Отметим, что у пациентов здоровой группы не изменяется фосфат/минеральное соотношение в зависимости от стадий профилактики. Это свидетельствует о балансе в норме между различными производными фосфатов, поступающими в биопленку. В то же время у участников кариозной подгруппы фосфат/минеральное соотношение значимо возрастает при использовании профилактических средств. Рост R2-соотношения на III этапе (прием таблеток, содержащих минеральный комплекс с глицерофосфатом) свидетельствует о превалировании в минеральной составляющей глицерофосфатов, т.е. о нарушении баланса производных фосфора, адсорбированных биопленкой. Характер изменений фосфолипид/липидного соотношения в зависимости от стадий профилактики и кариесогенной ситуации у пациентов аналогичен тому, что наблюдается для R1-соотношения.
Как следует из полученных результатов, существующие оральные профилактические меры могут быть недостаточны, а зачастую вредны, без учета персонифицированных данных о кариесогенной ситуации. Основная причина, вероятно, заключается в том, что вовлеченные микроорганизмы объединяются в сложные биопленочные сообщества со специфическими особенностями функционирования в норме и патологии, которые в свою очередь отличаются от особенностей планктонных клеток [1, 2, 9, 10]. Таким образом, контроль биопленки имеет основополагающее значение для здоровья полости рта и профилактики кариеса, гингивита и периодонтита.
Заключение
В нашей работе впервые изучены особенности молекулярного состава зубной биопленки на этапах экзо- и эндогенной профилактики у лиц с различной кариесогенной ситуацией с привлечением методов молекулярной спектроскопии.
На основе данных, полученных методом синхротронной FTIR, а также расчета соотношений между органическими и минеральными составляющими и статистического анализа данных, мы смогли оценить изменения, происходящие в молекулярном составе зубной биопленки.
Обнаруженные изменения величин фосфат/протеин/липидного, фосфат/минерального и фосфолипид/липидного соотношений, а также наличие статистически значимых внутри и межгрупповых различий в этих коэффициентах свидетельствуют о том, что у пациентов в норме и при развитии кариеса различаются механизмы адсорбции ионов, соединений и комплексов, пришедших из ротовой жидкости в зубную биопленку на этапе экзо/эндогенной профилактики. Важную роль здесь играет конформационное окружение и зарядовое взаимодействие в микробиоте, а также электростатическое состояние белковой сети биопленки пациентов с различной кариесогенной ситуацией.
Понимание изменений, происходящих в молекулярном составе зубной биопленки в зависимости от условий гомеостаза ротовой полости, позволит успешно перейти к персонализированному подходу в стоматологии и высокотехнологичному здравоохранению.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №21-15-00026.
Доступ к научному оборудованию и методологии предоставлен при поддержке Минобрнауки России, Соглашение №075-15-2021-1351.
Благодарность
Часть этого исследования была проведена с использованием оборудования лаборатории инфракрасной микроспектроскопии (IRM) на австралийском синхротроне.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.