Экспрессия генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой оболочки при хирургическом лечении пародонтита

В развитии воспалительных заболеваний пародонта важную роль играют защитные факторы слизистой оболочки полости рта (СОПР) [5, 8]. Эпителиальные клетки СОПР являются первой линией защиты организма от инфекции и играют решающую роль в отношении пародонтопатогенных бактерий [6, 11]. Они экспрессируют Toll-подобные рецепторы (TLR), которые распознают липополисахариды анаэробных бактерий, запускают экспрессию генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов-дефензинов и других медиаторов, регулирующих воспаление [6, 9, 12-14]. Продукция природных катионных пептидов-бета-дефензинов (HBD) является частью врожденного иммунитета и антимикробного иммунного барьера слизистых оболочек. HBD обладают широким спектром антимикробной активности, вызывая гибель микроорганизмов вследствие нарушения целостности их мембран [4, 7, 10].

Исследование факторов врожденного иммунитета при хирургическом лечении воспалительно-деструктивных поражений пародонта заключается в изучении их роли в процессе регенерации тканей пародонта, что позволит совершенствовать способы лечения больных с данной патологией.

Цель исследования - изучить роль экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках СО при хирургическом лечении воспалительно-деструктивных поражений пародонта.

Определение уровня экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках СО пародонта проведено у 10 здоровых лиц и 35 пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) в возрасте от 35 до 55 лет: у 24 пациентов был ХГП средней тяжести, у 11 - ХГП тяжелой степени. Пациенты со средней тяжестью ХГП получили традиционное лечение: санацию ПР, местную противовоспалительную терапию, антибиотикотерапию, снятие над- и поддесневых зубных отложений, устранение супраконтактов и функциональное избирательное пришлифовывание по Дженкельсону. После окончания комплекса лечебных мероприятий 9 из этих пациентов не дали согласие на дальнейшее хирургическое лечение (1-я подгруппа). Остальным 15 пациентам в дальнейшем были проведены лоскутные операции (2-я подгруппа). Хирургическое лечение заключалось в предоперационной подготовке и проведении лоскутных операций по методике Видмана-Неймана. Для заполнения костных дефектов использовали остеопластический материал Bio-Oss.

Обследование проводили до и после традиционного лечения, затем в динамике через 1, 3, 6 мес. Брали соскоб со слизистой десневого края для определения методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) экспрессии генов толл-рецепторов (TLR4) и противомикробных пептидов эпителия-бета-дефензинов (HBD-3). Из образцов была выделена РНК с использованием комплекта реагентов АмплиПРАЙМРибо-сорб («ИнтерЛабСервис», РФ) строго по протоколу. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов была получена кДНК с помощью реакции обратной транскрипции - ОТ (набор ОТ-1, «Синтол», РФ). На следующем этапе исследования с полученной в результате реакции ОТ кДНК проводили ПЦР-РВ на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, РФ). Реакция проводилась с использованием комплекта реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I («Синтол», РФ). Последовательность праймеров для определения уровня экспрессии данных генов подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0 (последовательности мРНК были получены в базе данных GeneBank). Системы для определения экспрессий генов TLR4 и HBD-3 были отработаны ранее [1, 2]. Уровень экспрессии исследуемых генов определяли относительно экспрессии гена GAP. Данные об экспрессии исследуемых генов представлены в виде количества копий соответствующего гена относительно 10⁶ копий гена GAP (исследование экспрессии гена TLR4) и 10³ копий гена GAP (исследование экспрессии гена HBD-3). Результаты выражали в медиане и процентилях (25-75-й). Для оценки достоверности различий применяли непараметрические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни. Различие показателей считалось достоверным при р<0,05 [3].

Показатели экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта представлены в табл. 1. У больных с воспалительно-деструктивными поражениями пародонта уровень экспрессии генов TLR4 и бета-дефензина (HBD-3) в эпителиальных клетках слизистой пародонта был повышен и достоверно отличался (p<0,05) от показателей у здоровых лиц.

У пациентов с ХГП средней тяжести уровень экспрессии генов TLR4 был повышен в 1,5-7,0 раза, а при тяжелой степени - в 4,5-20,5 раза, уровень экспрессии генов HBD-3 соответственно - в 1,5-5,0 и 2,0-6,5 раза.

Высокий уровень экспрессии генов распознающего рецептора TLR4 и дефензина HBD-3 эпителиальных клеток пародонта у пациента с ХГП по сравнению со здоровыми лицами свидетельствует о выраженной активности факторов врожденного иммунитета. При нарастании воспалительно-деструктивного процесса в пародонте экспрессия гена TLR4 в эпителиальных клетках резко возрастала (см. табл. 1). Изучаемые показатели можно рассматривать как маркеры воспалительной реакции в тканях пародонта.

В табл. 2 показаны уровни экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта после комплексного традиционного лечения у пациентов с ХГП средней тяжести. Анализ результатов свидетельствовал о нормализации показателей врожденного иммунитета в течение 1 мес. В сроки 3-6 мес у больных 1-й подгруппы отмечалась тенденция к повышению показателей врожденного иммунитета, что клинически совпадало с явлениями воспаления в пародонте.

Влияние хирургического лечения на уровень экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта у пациентов 2-й подгруппы представлено в табл. 3.

Изучение показателей в динамике после лоскутных операций свидетельствует о том, что до лечения они находились в пределах нормы (см. табл. 3). При проведении лоскутных операций уровень показателей в течение 1 мес снижался в среднем в 2 раза от исходного, затем в сроки 3-6 мес он повышался до нормальных значений.

Таким образом, при воспалительно-деструктивных поражениях пародонта экспрессия генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта повышена; изменения наиболее выражены при тяжелой степени заболевания, что указывает на активацию факторов врожденного иммунитета в ответ на патогены, т. е. активация экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта может рассматриваться как важный маркер нарушения механизмов защиты слизистой пародонта и развития хронического воспаления. Традиционное комплексное лечение, включающее в себя противовоспалительную терапию, положительно влияло на уровень экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта - он нормализовался в течение 1 мес, а в дальнейшем повышался, что клинически совпадало с явлениями воспаления в пародонте. Важное условие для проведения восстановительных операций на пародонте - нормальные показатели защитных факторов иммунитета. Хирургическое лечение, включающее в себя лоскутные операции с применением остеопластического материала, способствовало кратковременному снижению уровня экспрессии генов TLR4 и HBD-3 в эпителиальных клетках слизистой пародонта. Снижение данных показателей можно объяснить лечебными мероприятиями. Наблюдение пациентов в динамике в сроки от 3 до 6 мес показало, что послеоперационный период протекал на фоне нормальных показателей экспрессии генов TLR4 и HBD-3.