Пародонтит характеризуется прогрессирующей деструкцией тканей пародонта и альвеолярной кости. В развитие пародонтита, несомненно, вносят вклад наследственный фактор и факторы окружающей среды. В качестве основного фактора, непосредственно определяющего начало заболевания, большинством исследователей [19] рассматривается микрофлора пародонта. Классификация пародонтита в различных странах имеет свои особенности, во всем мире признается деление пародонтита на агрессивный и хронический. Хронический пародонтит чрезвычайно распространен в популяции: в зрелом возрасте (после 35-40 лет) в той или иной степени он неизбежен, но время начала этого заболевания в существенной мере зависит от индекса гигиены ротовой полости [2]. Напротив, риск развития агрессивного пародонтита - менее распространенного, но более тяжелого заболевания, мало зависит от гигиенического состояния пародонта и в большей мере определяется наследственностью [20, 21]. Несмотря на то что указанные различия в этиологии агрессивного и хронического пародонтита доказаны и никем не оспариваются, вопрос о различиях в составе микрофлоры пациентов со здоровым пародонтом, хроническим и агрессивным пародонтитом остается до конца не решенным и не теряет актуальности. Это объясняется тем, что именно целенаправленное воздействие на микробиом человека является, в отличие от его генотипа, возможным, хотя и технически непростым подходом.

Важность изучения факторов риска возникновения агрессивного пародонтита определяется еще и тем, что в Российской Федерации распространенность этого заболевания у пациентов в возрасте до 25 лет за последнее десятилетие выросла почти в 10 раз. Очевидно, что существенное изменение генотипа популяции в течение этого срока невозможно. Мы предполагаем, что существенным фактором, повлиявшим на этот процесс, является повсеместное распространение средств профилактики кариеса (зубные пасты, жевательные резинки, полоскания), целенаправленно влияющие на состав микробиома пародонта.

В настоящее время имеется несколько опубликованных работ о составе микробиома пародонта у пациентов с агрессивным пародонтитом, выполненных современными высокопроизводительными методами: с помощью NGS-секвенирования [14-17] и гибридизации на микрочипах (HOMIM) [4]. Однако авторы этих работ акцентировали свое внимание преимущественно на пародонтопатогенах, не уделяя достаточного внимания потенциальной пародонтопротекторной микрофлоре.

Выявленные и обсуждавшиеся в перечисленных работах пародонтопатогены в основном представляют собой Aggregatibacter actinomycetemcomitans и пять компонентов так называемого оранжевого комплекса по Сокранскому: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Treponema denticola и Tannerella forsythia, которые давно известны и могут быть выявлены и без использования NGS-технологий с помощью общедоступных наборов для ПЦР в реальном времени. Кроме них в работах [4, 13, 17] акцентируется внимание на важной роли в развитии агрессивного пародонтита видов Parvimonas micra и Filifactor alocis.

Несмотря на хорошую сходимость данных представленных работ, их использование для клинической диагностики пародонтита осложнено отсутствием удобных стандартных маркеров.

С учетом изложенного, целью настоящей работы было охарактеризовать состав микробиома пациентов с бесспорными случаями агрессивного пародонтита с применением технологии NGS-секвенирования, сравнивая его с микробиомом пациентов, не склонных к развитию пародонтита. При этом важной задачей являлся оптимальный выбор OTU (operational taxonomic units) для сравнения выборок. В этом качестве независимо рассматривались таксономические единицы ранга рода и вида. Особое внимание было уделено сопоставлению данных, получаемых на одних и тех же образцах, методами NGS-секвенирования и ПЦР в реальном времени, поскольку основным предназначением данных, полученных при использовании NGS-секвенирования на ограниченных выборках, являлось развитие методов рутинной клинической диагностики на основе ПЦР в реальном времени.

Для создания полной картины при исследовании состава патогенной и нормальной бактериальной микрофлоры в образцах биологических материалов человека были сформированы две группы пациентов.

Всего были обследованы 215 человек обоего пола в возрасте от 18 до 65 лет без тяжелых хронических общесоматических заболеваний.

В 1-ю группу вошли 22 пациента без признаков пародонтита, при отборе кандидатов в эту группу учитывался возраст. Отбирались пациенты в возрастной группе старше 40 лет, так как при выборе более молодых кандидатов существовал риск включения в группу пациентов с хроническим пародонтитом со стертой симптоматикой.

2-ю группу составили 40 пациентов с агрессивным пародонтитом.

Отбор образцов осуществлялся путем введения специального штифта в пародонтальный карман (в случае пародонтита) или в десневые бороздки вокруг зуба (в случае здорового пациента) на глубину 2-5 мм. Далее штифт помещали в реактив для хранения образцов из набора Проба-Рапид объемом 500 мкл.

У каждого пациента брали по 2 образца: один с верхней челюсти, второй с нижней (маркировались эти образцы как А и Б от каждого пациента). Развитие пародонтита может быть неравномерным, поэтому забор биологического материала из разных точек может дать более полную картину и позволит усреднить результаты в случае их неравномерности. Часто заболевание в первую очередь поражает жевательные зубы, поэтому пробы брали из десневой бороздки или пародонтального кармана жевательных зубов.

Каждым участником исследования было подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения: лица обоего пола, принадлежащие к европеоидной расе, в возрасте от 18 до 65 лет, проживающие на территории Москвы и Московской области.

Критериями исключения являлись:

- системные заболевания соединительной ткани;

- злокачественные заболевания, курсы химиотерапии и лучевой терапии в анамнезе;

- острые инфекционные и вирусные заболевания;

- поливалентная аллергия;

- беременность и лактация;

- непонимание цели исследования и отсутствие добровольного информированного согласия.

Перед проведением исследования была разработана специальная анкета, отражающая все необходимые для исследования параметры.

Экстракция нуклеиновых кислот.

Для выявления инфекционных агентов и определения геномной ДНК пациента (как нормировочного показателя) экстракцию ДНК из биологического материала проводили с помощью комплектов для экстракции ДНК Проба-ГС и Проба-Рапид (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) согласно прилагаемым инструкциям, а также традиционным методом экстракции смесью фенол-хлороформ.

Набор Проба-ГС основан на сорбции ДНК на носителе, отмывке примесей и последующей элюции нуклеиновых кислот с сорбента. За счет лизиса клеток сильными хаотропными агентами Проба-ГС примерно с равной эффективностью разрушает клетки с различным типом клеточной стенки (грамположительные, грамотрицательные бактерии, грибы). Также Проба-ГС подходит и для экстракции геномной ДНК эукариот (использованной в исследовании в качестве нормировочного показателя). Набор Проба-Рапид предназначен для быстрого лизиса биомассы сочетанием химической обработки денатурантами и термической обработки без дополнительной очистки нуклеиновых кислот. Метод экстракции смесью фенол-хлороформ основан на отделении белков от нуклеиновых кислот за счет наличия у белков амфифильных свойств, приводящих к образованию им интерфазы на границе раздела органической и водной фаз эмульсии. При этом ДНК и РНК полностью остаются в водной фазе, откуда могут быть собраны осаждением спиртами.

Для определения качественного и количественного соотношения пародонтопатогенных бактерий полости рта использовали метод ПЦР в реальном времени.

В работе были использованы ранее разработанные наборы реагентов, состоящие из специфичных праймеров и специфичной флюоресцентно меченной разрушаемой пробы (типа TaqMan), к шести пародонтопатогенным агентам (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia (Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Candida albicans). ПЦР проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-322 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Учет результатов реакции проводили с помощью программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-322.

Комплект реагентов предназначен для определения и приблизительной оценки количества геномной ДНК основных классов патогенной микрофлоры полости рта и геномной ДНК человека методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в биологическом материале человека. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутреннего контрольного образца, мечены флюоресцентными метками Fam и Hex соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации ДНК исследуемых образцов.

Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенной прослойкой из парафина. Учет результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором. Интерпретация результатов проводится с учетом значений Cp по каналу специфики (канал Fam) и внутреннего контроля (Hex).

Оценка качества и количества выделяемой ДНК осуществлялась методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для получения полной картины, выделенная ДНК исследовалась на содержание общей бактериальной массы, на содержание ДНК человека и на наличие ДНК основных представителей бактериальной патогенной микрофлоры (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia , T. denticola, C. albicans).

Клиническое обследование пациентов начинали со сбора жалоб и анамнеза. На этом этапе особое внимание уделяли возрасту возникновения первых жалоб и их характеру, а также наличию или отсутствию подобных жалоб по линии ближайших родственников. Далее приступали к внешнему осмотру - визуально оценивали конфигурацию лица, состояние кожных покровов и красной каймы губ. Затем переходили к пальпаторному исследованию регионарных лимфатических узлов. Осмотр рта начинали со стороны преддверия, определяя состояние слизистой оболочки, фенотип десны, анатомо-топографические особенности, включая глубину преддверия и прикрепление уздечек и тяжей. Регистрировали количество зубов, наличие пломб, шинирующих и ортопедических конструкций. Глубину пародонтальных карманов измеряли при помощи пародонтального градуированного зонда в области каждого зуба с 6 точек. Для максимальной объективизации и цифрового выражения уровня гигиены полости рта, степени воспаления тканей пародонта применяли стандартные методики определения индексов Silness-Loe (1967), Muhlemann-Cowell, а степень подвижности зубов определяли по Miller в модификации Flezar. В качестве дополнительного метода обследования для уточнения состояния костного субстрата использовали цифровую ортопантомограмму.

Основными критериями для постановки диагноза агрессивный пародонтит являлись:

а) подростковый возраст возникновения первых жалоб (кровоточивость десен, периодическое абсцедирование);

b) возраст пациента на момент обращения не более 35 лет;

c) отягощенность по линии ближайших родственников;

d) удовлетворительный уровень гигиены рта;

e) минимальная глубина пародонтальных карманов 5 мм;

f) наиболее глубокие поражения в области первых резцов и первых моляров;

g) конвергенция корней моляров при рентгенологическом анализе;

h) несоответствие клинической и рентгенологической картины: последняя оказывалась более неблагоприятной.

Пробы отбирали с помощью стерильного бумажного штифта по 4 пробы от каждого пациента: две пробы «А» из пародонтального кармана в области первых моляров (при их отсутствии - в области премоляров) и две пробы «Б» из пародонтального кармана резцов). Штифт погружали в поддесневую полость на максимальную глубину и удерживали там в течение 5 с. Затем каждый штифт помещали в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 0,5 мл раствора Проба-Рапид.

ДНК из полученных таким образом смывов пародонта выделяли с помощью комплекта реагентов Проба-ГС (ООО «ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя. Очищенные препараты ДНК, полученные из 50 мкл смыва, доводили до конечного объема 50 мкл и анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием набора Дентофлор (ООО «ДНК-Технология», Россия). При этом использовалось 5 мкл препарата ДНК на реакцию. Данный набор позволяет определять суммарное количество бактериальной 16S рДНК, содержание специфических мишеней геномной ДНК шести пародонтопатогенов A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola, T. forsythia и Candida albicans и количество геномной ДНК человека.

По итогам ПЦР-анализа пять наиболее качественных препаратов ДНК из каждой выборки использовали для получения библиотеки с помощью ПЦР со специфическими праймерами на 16S рДНК. Полученные библиотеки анализировали с помощью NGS-секвенатора Illumina MiSeq. Для каждого образца удалось определить около 10 000 индивидуальных последовательностей.

Полученные последовательности 16S рДНК относили к определенному роду бактерий с помощью процедуры автоматического поиска Blast по базе данных NCBI GenBank. Статистическая разница в представленности каждого рода бактерий у пациентов и в контрольной когорте рассчитывалась с помощью пакета Statistica, при этом для сравнения различий в представленности видов и родов в выборках использовалось соотношение критерия Фишера (p≤0,05) и t-критерия Стьюдента.

Из четырех независимо отобранных проб каждого больного (2 типа «А» и 2 типа «Б») с помощью набора Проба-ГС выделяли суммарную ДНК. Качественную и количественную характеристику проводили с помощью набора Дентофлор. При этом результат анализа выражали в виде параметра Ct - пороговый цикл, обратно пропорционального логарифму концентрации ДНК по основанию 2. Пробы, в которых Ct превышал 22 цикла, не использовались в дальнейших исследованиях, чтобы избежать риска непропорциональной потери ДНК тех или иных таксономических групп бактерий при выделении ДНК.

В результате из первичной выборки у 40 пациентов с жалобами на состояние пародонта было отобрано 8 с диагнозом агрессивный пародонтит. Контрольная выборка состояла из семи лиц без признаков поражения пародонта.

Для секвенирования продукта ПЦР, соответствующего фрагменту 16S рДНК, мы выбрали в качестве мишени гипервариабельный участок V6, соответствующий позициям 984-1047 гена 16S рДНК Escherichia coli. Несмотря на небольшую длину, он позволяет с высокой точностью детектировать видовую принадлежность бактерий [18]. С помощью базы данных Silva был проведен анализ с применением компьютерного моделирования, который показал, что более 97% вариантов V6 можно однозначно идентифицировать до уровня рода [13]. Помимо высокой вариабельности, участок V6 16S pДНК удобен тем, что он уже использовался во многих исследованиях [14, 15, 26]. Более того, более длинные вариабельные участки в целом более склонны к формированию гибридных молекул в ходе ПЦР, что отрицательно сказывается на точности анализа. С помощью прибора Illumina MiSeq была автоматически определена последовательность общей длиной 4 892 600 нуклеотидов или от 599 933 до 650 416 нуклеотидов на образец.

Дальнейшая обработка последовательностей привела к исключению из рассмотрения 12,5% данных первичного секвенирования в связи с их недостаточным качеством. Большинство последовательностей были исключены из дальнейшего анализа из-за гетерогенности образца (~8%) и большой доли нечитаемых позиций (~4,5%). Химерные последовательности были обнаружены только в незначительных количествах (менее 1% за пробу). Последовательности каждого набора данных были в дальнейшем обработаны с помощью SLP, за счет чего от 9 до 14% всех данных были скорректированы с целью устранения потенциальных ошибок в секвенировании, в результате чего было получено от 5210 до 8 462 уникальных маркерных последовательностей на образец. Исключение ОТU, встречавшихся в выборке только один раз, уменьшило число ОТU, подвергшихся статистическому анализу, сократило общее число анализируемых таксонов примерно на 50%. Однако при этом было исключено из рассмотрения только на 0,5% секвенированных последовательностей. Число ОТU, встречавшихся более одного раза на образец, варьировало от 1648 до 2659 на пробу.

Для каждой выборки было подсчитано арифметическое значение получившихся данных. Затем для каждой ОТU рассчитывалось значение Т с учетом его релевантности для дифференцировки выборок. Значение Т более 3 означало статистически значимое преобладание ОТU в выборке 1 (здоровые лица). Значение Т 2-3 означало, что ОТU имеет некоторую связь со здоровым фенотипом. Значение Т менее –3 означает статистически значимую ассоциацию ОТU с агрессивным пародонтитом. Если же значение Т варьируется между –2 и –3, то это значит, что ОТU незначительно преобладает у пациентов с агрессивным пародонтитом. Значение Т между –2 и 2 означает, что появление ОТU никак не связано с агрессивным пародонтитом.

Анализ данных показал, что род Veillonella - единственная ОТU, четко связанная с высокой степенью сохранности пародонта. Более того, это одна из самых многочисленных бактериальных групп (занимает третье место после Fusobacterium и Prevotella у здоровых лиц). Согласно нашим данным, у пациентов с агрессивным пародонтитом количество этих бактерий в 4-5 раз меньше, чем у здоровых лиц, что однозначно представляет собой отрицательный клинический признак. Более того, низкая погрешность в параметре С2 свидетельствует об отсутствии агрессивного пародонтита в случае, когда эта бактерия присутствует в нормальном количестве.

Что касается других пяти ОТU, характерных для здорового пародонта, то здесь корреляция выражена не так явно. Речь идет о родах Streptococcus, Bergeyella, Granulicatella, Kingella и Corynebacterium.

Было обнаружено, что повышенная представленность на пародонте 8 ОТU: Porphyromonas, Treponema, Synergistaceae, Tannerella, Filifactor, Ruminococcaceae, Parvimonas и Mycoplasma - ассоциирована с агрессивным пародонтитом. Интересно, что преобладание родов Treponema, Synergistaceae и Filifactor сильнее всего ассоциируется с заболеванием, в то время как общеизвестные пародонтальные патогены: Porphyromonas и Tannerella - показывают лишь некоторую тенденцию к такой связи. Более того, колонизация пародонта родами Prevotella [12] и Aggregatibacter [7] оказалась никак не связана с агрессивным пародонтитом, хотя именно эти виды считаются самыми опасными инфекционными возбудителями, напрямую ответственными за разрушение пародонтальной ткани. Возможно, объяснить это можно тем, что только определенные серотипы A. аctinomycetemcomitans обладают высокой патогенностью, в то время как другие серотипы вида и другие представители рода Aggregatibacter могут быть никак не связаны с агрессивным пародонтитом [5].

Учитывая, что данные о клиническом воздействии нескольких ОТU (например, Filifactor, Prevotella и Aggregatibacter) не соответствовали ранее имевшимся данным [7], была проведена дополнительная проверка качества выделения ДНК. Кроме того, для дальнейшего применения ПЦР набора Дентофлор в клинической практике необходимо было провести сравнение представленности каждого клинически значимого OTU по данным метагеномного секвенирования и по данным ПЦР РВ.

Согласно данным, полученным в ходе сравнения ПЦР с помощью набора Дентофлор, в пародонтальной микрофлоре всех лиц (включая здоровых и пациентов с агрессивным пародонтитом) полностью отсутствует Aggregatibacter actinomycetemcomitans(табл. 1).

Аналогичным образом было выполнено сравнение данных ПЦР РВ и метагеномного секвенирования для других известных пародонтопатогенов: P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola(табл. 3).

В ходе исследования выявлено 6 родов потенциальных пародонтопротекторов и 8 родов потенциальных пародонтопатогенов.

Определялось статистически достоверное повышение представленности у больных агрессивным пародонтитом восьми родов бактерий: Porphyromonas, Treponema, Synergistes, Tannerella, Filifactor, Ruminococcus, Parvimonas, Mycoplasma, из которых только три - Porphyromonas, Treponema и Tannerella традиционно рассматриваются как пародонтопатогены. У лиц со здоровым пародонтом было впервые выявлено статистически достоверное доминирование рода Veillonella, которое, таким образом, должно рассматриваться в качестве важного критерия здоровья пародонта.

При статистическом анализе в качестве OTU видов бактерий было установлено, что существенную роль в поддержании здоровья пародонта играет соотношение видов в пределах рода Prevotella, представители которого составляют значительную долю консорциума. Доминирование вида P. intermedia ассоциировано с пародонтитом, тогда как доминирование комплекса видов Р. nigrescens, P. oris, P. veroralis, напротив, ассоциировано с высокой сохранностью пародонта. Интересно, что наиболее опасный пародонтопатоген Aggregatibacter actinomycetemcomitans не был выявлен ни у одного из больных, что не позволяет считать его главной причиной роста заболеваемости агрессивным пародонтитом в Москве.

Впервые выявлены комплексы бактерий, ассоциированных со здоровым пародонтом, численность которых оказывается взаимно зависимой. В состав основного «защитного комплекса» входят виды рода Veillonella и непатогенные представители Prevotella. В качестве альтернативного «защитного комплекса», способного функционально замещать главный комплекс, может рассматриваться группа видов Streptococcus sanguinis, Kingella oralis, Granulicatella paradiacens и представители рода Bergeyella.

Настоящее исследование поддержано грантом №2014-14-576-0072-6341, предоставленным в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», мероприятие 1.2.