Формирование биопленок антагонистическими штаммами лактобацилл полости рта

Одной из важнейших проблем современного здравоохранения являются гнойно-воспалительные заболевания полости рта, в основе которых лежит нарушение микробиоценоза. Слизистая оболочка ротовой полости покрыта биопленками из микроорганизмов, которые по видовому составу строго соответствуют своей области обитания. Изменение состава или удаление привычных микробных консорциумов моментально освобождает вакантные участки для других обитателей, включая выраженных патогенов. Из этого следует, что любые лечебные воздействия должны осуществляться с оглядкой на возможный урон, который они смогут нанести бактериям нормальной микрофлоры. В таком случае неоценима роль пробиотиков, которые вырабатывают антимикробные факторы (молочную кислоту, бактериоцины, лизоцимы и др.) и избирательно элиминируют патогены, за счет чего восстанавливается исходный микробиоценоз [13].

Пробиотические бактерии должны обладать набором свойств, позволяющих им конкурировать с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. К таким признакам относятся: антагонистическая активность, способность к адгезии на твердых поверхностях полости рта, аутоагрегации, поверхностной гидрофобности, коагрегации, способность формировать биопленки и не подавлять представителей нормальной микрофлоры, т.е. безопасность в применении [1, 3, 7]. Известно, что Lactobacillus fermentum RC-14 и его поверхностно-активные вещества подавляют воспаление хирургических имплантатов, вызванное S. aureus, как наиболее частая причина внутригоспитальных инфекций путем ингибирования адгезии патогенного штамма [10].

Для профилактики и коррекции дисбактериозов полости рта крайне перспективным и экономически выгодным является создание доступных пробиотических препаратов на основе высокоантагонистических штаммов лактобацилл.

Цель исследования — изучить способность антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей, формировать биопленки, предотвращающие рост и размножение представителей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов полости рта.

Материалом для исследования служили 3 антагонистически активных штамма лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей в возрасте 7—30 лет. Все люди на момент обследования были клинически здоровы, не имели в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний желудочно-кишечного тракта и других систем органов. Выделенные штаммы лактобацилл по результатам анализа гена 16S рРНК были идентифицированы как L. fermentum 39, L. rhamnosus 50, L. rhamnosus 24 [2, 4].

Данные штаммы проявили высокую антагонистическую активность по отношению к производственным культурам: Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans 531, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis, Escherichia coli BVK O83.

Лактобациллы выращивали на среде МРС (DifcoTM Lactobacilli MRS Agar, BD, USA) как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Оптимальная температура культивирования 37 °С, время культивирования 24—48 ч.

Степень адгезии лактобацилл определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу В.И. Брилис (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ [6].

Аутоагрегация лактобацилл определялась методом A. Andreu и соавт. (1995). Культуры выращивали в течение 24 ч в мясо-пептонном бульоне при температуре 37 °С. Клетки были ресуспендированы в фосфатно-солевом буфере (рН=6,2) до конечной концентрации 5·10⁹ КОЕ/мл. Капля суспензии была помещена на предметное стекло и оценена макро- и микроскопически. Аутоагрегация оценивалась как способность формировать скопления (агрегаты) в течение 2 мин [11].

Поверхностная гидрофобность лактобацилл [11] изучалась по тесту солевой агрегации (ТСА). Бактерии были ресуспендированы в фосфатно-солевом буфере (рН=6,8) до конечной концентрации 5·10⁹ КОЕ/мл. Растворы сульфата аммония (4,0; 2,0; 1,5; 0,5 моль/л) были смешаны с равными объемами клеточной суспензией на предметном стекле. Наименьшая конечная концентрация сульфата аммония, вызывающая агрегацию бактерий, была определена как значение ТСА. По данному значению бактерии были разделены на три группы: высокая поверхностная гидрофобность (ТСА<0/9 моль/л), средняя гидрофобность (ТСА 0,9—1,5 моль/л), гидрофильность (ТСА>1,5 моль/л).

Способность лактобацилл к коагрегации определялась методом G. Reid и соавт. (1990). Была приготовлена суспензия исследуемой культуры в фосфатно-солевом буфере с оптической плотностью 540 нм. Кратные 0,5 мл объемы были смешаны с равными объемами тестовых культур, а затем инкубированы в течение 4 ч при 37 °С. В качестве тестовых культур для данной методики были использованы следующие штаммы: патогенные и условно-патогенные микроорганизмы Staphylococcus aureus 209, Candida albicans 531, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Escherichia coli АТСС 25922; Salmonella typhimurium 11, Shigella flexneri 26, Bacillus subtilis 534. После этого суспензии окрашивали по Граму и микроскопировали. Тест коагрегации был положительным, если исследуемая культура образовывала агрегаты с другим видом микроорганизмов [9].

Тестирование лактобацилл на способность формировать биопленки проводили в стерильных пластиковых чашках Петри (диаметром 90 мм) со стеклышками для оценки способности к формированию биопленок на пластике и стекле по методике, описанной Ю.М. Романовой (2006) (см. рис. 1, 2 на цв. вклейке).

Биосовместимость исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактериями определялась методом совместного культивирования на твердой питательной среде (Н.А. Глушанова, 1999).

Суточную культуру исследуемого штамма лактобацилл, выращенную на жидкой питательной неселективной среде, наносили на поверхность плотной питательной неселективной среды в чашках Петри бактериологической петлей диаметром 2—3 мм и оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капли [5]. После этого, отступив 1—2 мм от края первого пятна, наносили каплю суточной тестовой культуры бифидобактерий, выращенной на жидкой питательной среде. Бифидобактерии культивировали на среде БС (бифидум среда), изготовитель ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии г. Оболенск в анаэробных условиях с использованием анаэростата (BBL® USA) и газогенераторных пакетов GasPak Plus (BBL® USA). Растекаясь, вторая капля затекала на пятно исследуемой культуры, примерно на половину диаметра. В наложенной части культуры развивались при взаимном присутствии (совместное культивирование), конкурируя друг с другом. Свободные части пятен каждой культуры служили контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капли второй культуры чашки с посевами инкубировали крышкой вниз при температуре 37 °C в термостате. Одновременно с основным опытом ставили контрольные опыты — наслаивали две капли исследуемого штамма и две капли тестовой культуры. Предварительный учет результатов проводили через 18—20 ч инкубации, окончательный учет результатов через 48 ч. Результат учитывали по наличию признаков подавления или даже зоны задержки роста чувствительной культуры (см. рис. 3, 4 на цв. вклейке).

Сущность метода определения пероксида водорода лактобациллами заключается в том, что при культивировании бактерий на питательной среде, содержащей фермент пероксидазу и индикатор на кислород, можно определить образование пероксида водорода бактериями по специфическому окрашиванию колоний в синий цвет [12].

Сначала проводят посев петлей исследуемой культуры методом штрихов на питательную среду, содержащую пероксидазу хрена и бензидин (тетраметилбензидин). Затем лактобациллы культивируют при температуре 37 °С в течение 24—48 ч в эксикаторе со свечей. Колонии, образующие пероксид водорода (H₂O₂), приобретают синий цвет. Остальные колонии бесцветные.

Анализ данных по изучению способности исследуемых штаммов лактобацилл, L. fermentum 39, L. rhamnosus 24 и L. rhamnosus 50, к формированию биопленок представлены в табл. 1.

Штамм Lactobacillus fermentum 39 обладает высокой аутоагрегацией и поверхностной гидрофобностью, средним показателем адгезии, средней способностью к образованию биопленок, не продуцирует перекись водорода. При изучении коагрегации выявлено, что Lactobacillus fermentum 39 коагрегирует с E.coli, Staphylococcus spp., Candida albicans, Bacillus spp.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 24 обладает высокой аутоагрегацией и поверхностной гидрофобностью, средним показателем адгезии, средней способностью к образованию биопленок, сильно продуцирует перекись водорода. При изучении коагрегации выявлено, что Lactobacillusrhamnosus 24 коагрегирует только с Bacillus spp.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 50 обладает высоким показателем адгезии, высокой способностью к образованию биопленок, средней аутоагрегацией и поверхностной гидрофобностью, слабо продуцирует перекись водорода. При изучении коагрегации выявлено, что Lactobacillusrhamnosus 50 коагрегирует с Bacillus spp. и Staphylococcus spp.

При определении биосовместимости исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактериями методом совместного культивирования были взяты типовые и производственные штаммы бифидобактерий, предоставленные НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (табл. 2).

В результате установлено, что исследуемые лактобациллы не оказывают антагонистического воздействия между собой, а также с бифидобактериями, о чем свидетельствует отсутствие зоны задержки роста чувствительной культуры (см. рис. 2 на цв. вклейке).

Высокая степень аутоагрегации, поверхностной гидрофобности и адгезии у большинства штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта, определяет выраженную способность к образованию биопленок. Разная выраженность коагрегации свидетельствует о том, что данные пробиотические штаммы характеризуются селективностью воздействия по отношению к определенным видам микроорганизмов. Таким образом, выделенные штаммы лактобацилл, L. rhamnosus 24, L. rhamnosus 50 и L. fermentum 39, наряду с их высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и способностью входить в состав биопленок, могут использоваться для создания новых штаммов пробиотиков. Данные штаммы также могут комбинироваться с пробиотическими штаммами бифидобактерий и могут быть использованы при совместном лечении гнойно-воспалительных заболеваний полости рта.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки, госконтракт №02.522.12.2009.