Влияние кратковременного нарушения условий культивирования эмбрионов трех суток на их развитие и потенциал к имплантации

Культивирование эмбрионов, полученных в программах ЭКО, является важнейшим этапом на пути к наступлению беременности и рождению здорового ребенка. В настоящее время уделяется большое внимание контролю качества этого этапа, что включает контроль условий культивирования: температуры, рН среды культивирования, осмолярности и т. д. [1]. Одним из важных критериев оценки качества культивирования является частота имплантации эмбрионов.

В настоящее время общепринятым является культивирование эмбрионов до 5-х суток развития. Показано, что частота наступления беременности, а также рождения ребенка статистически выше при переносе эмбрионов на 5-е сутки развития, чем при переносе эмбрионов 3-х суток развития, что обусловлено возможностью отбора эмбрионов наивысшего качества, достигших стадии бластоцисты [2—4]. Наилучшей стратегией культивирования эмбрионов является их непрерывное пребывание в оптимальных условиях. Современные инкубаторы и усовершенствованные культуральные среды позволяют контролировать большинство параметров без вмешательства. Существует две причины нарушения «идеальных условий культивирования»: необходимость получения информации об оплодотворении и развитии эмбриона, а также использование многоступенчатых сред для культивирования, что однозначно приводит к переносу эмбрионов из одной среды культивирования в среду следующей ступени. При этом происходит кратковременное изменение нескольких параметров: рН среды, температуры, условий освещенности. Такие нарушения являются факторами риска, влияющими на качество эмбрионов и их потенциал к имплантации.

Влияние каждого из этих факторов описано в литературе. Для сред культивирования общепринятым является карбонатный буфер, регулирующий pH среды. Оптимальное культивирование осуществляется в газовом инкубаторе с 5,5—6% содержанием СО₂, которое поддерживает рН 7,2—7,3. Даже незначительное повышение pH во время манипуляций вне инкубатора существенно влияет на гомеостаз (ферментативная активность, клеточное дробление, дифференцировка, транспорт через мембраны, элементы цитоскелета) и уровни экспрессии генов [5—7].

Один из важнейших факторов культивирования — поддержание температуры. Ооцит является наиболее чувствительным к изменениям температуры in vitro. Изменение температуры даже на 1 °C приводит к разборке веретена деления, восстановление которого происходит не всегда [6, 8]. Данные нарушения веретена деления приводят к анеуплоидиям, нарушениям развития эмбрионов и снижению их потенциала к имплантации. Эмбрион на стадии дробления также весьма чувствителен к изменениям температуры. Толерантность к изменениям температуры несколько увеличивается после стадии компактизации (стадия морулы).

Кратковременное нарушение условий культивирования, возникающее из-за необходимости визуальной оценки эмбриона, также может быть связано с воздействием источника света. В условиях in vivo эмбрион не подвергается воздействию источников света. При культивировании in vitro основное время эмбрион также находится в темноте. Показано, что воздействие света может оказывать как прямое влияние на эмбрионы (повреждение ДНК, митохондриальная дегенерация, образование активных форм кислорода в цитоплазме) [9], так и опосредованное через фотоокисление компонентов среды (например, рибофлавин, распадающийся до триптофана, замедляет дробление эмбрионов) [6]. Показано также, что воздействие света на парафиновое масло может приводить к каскадной реакции пероксидов, результатом которой является перенос водорастворимых контаминантов в культуральную среду [10].

Для минимизации воздействия этих факторов перевод из одной среды в другую стараются сочетать с оценкой развития эмбриона, что позволяет избежать многократного нарушения условий культивирования, однако это приводит к увеличению времени нахождения эмбрионов вне оптимальных условий. Актуальным вопросом является поиск равновесия между стабильностью условий культивирования и практической необходимостью получения информации о развитии эмбрионов.

Цель исследования — оценить влияние кратковременного нарушения условий культивирования эмбрионов 3-х суток, неизбежно возникающего при световой микроскопии во время оценки морфологических параметров, на их дальнейшее развитие и потенциал к имплантации.

Стимуляцию яичников в контролируемых циклах ЭКО выполняли с использованием либо длинного протокола down-регуляции с назначением агониста ГнРГ, либо короткого протокола с антагонистом ГнРГ. Контроль за индуцируемым фолликулогенезом проводили с помощью УЗИ. Фолликул расценивали как функционально зрелый при достижении размера 17—18 мм и уровня эстрадиола в сыворотке крови не менее 300 пмоль/л в расчете на каждый фолликул диаметром более 15 мм. День введения триггера финального созревания фолликулов определяли на основании среднего диаметра доминантного фолликула (не менее 17 мм) и толщины эндометрия (не менее 8 мм).

Трансвагинальная пункция (ТВП) фолликулов проводилась через 35—36 ч после введения триггера овуляции. Оплодотворение осуществлялось не позднее чем через 40 ч после введения триггера (гонадотропин хорионический). Оценка оплодотворения происходила спустя 16—20 ч. Эмбрионы культивировали группами не более 5 эмбрионов в каплях среды под минеральным маслом в трехступенчатой системе культивирования. На 1-е и 3-и сутки развития эмбрионов осуществлялась смена сред с учетом рекомендаций производителя. Оценка эмбрионов на 3-и и 5-е сутки производилась с использованием классификации по Гарднеру [11], одновременно с переводом в среду следующего этапа культивирования. При этом у 730 (58%) пациенток на 3-и сутки эмбрионы максимально быстро переводили в среду следующей стадии культивирования под контролем бинокуляра, без подробного морфологического описания эмбрионов, тогда как у 523 (42%) пациенток на 3-и сутки происходила оценка качества эмбрионов под инвертированным микроскопом NIKON Ti с последующим протоколированием, что увеличивало время нахождения вне инкубатора на 30 с (на каждые 5 оцененных эмбрионов).

В соответствии с поставленной целью были проанализированы результаты программ ЭКО у 1744 больных с бесплодием в возрасте от 23 до 46 лет по числу эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, и по показателям частоты наступления беременности (ЧНБ) на перенос эмбрионов 5-х суток развития (выявление с помощью УЗИ плодного яйца на 21-е сутки после ПЭ). Кроме того, была оценена результативность программ ЭКО при переносе эмбрионов 3-х суток (491 пациентка) и 5-х суток (1253 пациентки).

Полученные результаты обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, представленных в программе R 3.3.2 с использованием точного критерия Фишера. Для учета эффекта множественных сравнений при анализе разных возрастных групп применяли поправку Бонферрони, в связи с чем критический уровень значимости р=0,01.

На основании анализируемых данных можно видеть, что перенос эмбрионов в основном осуществлялся на 5-е сутки развития — 72% (табл. 1),

Можно увидеть, что при оценке эмбрионов на 3-и сутки развития у пациенток старшего репродуктивного возраста имеет тенденцию к снижению ЧНБ (табл. 2)

Анализ количества полученных бластоцист показал наличие статистически достоверных различий при проведении оценки качества эмбрионов и без их оценки в возрастных группах пациенток до 39 лет (табл. 3, рис.

Предымплантационный период развития эмбрионов — один из самых чувствительных периодов в развитии организма. Культивирование in vitro является наиболее важным фактором в изменениях эпигенетического перепрограммирования и развития эмбрионов в программах ЭКО. Все большее число исследований подтверждают влияние культуральной среды на эпигенетическое предымплантационное развитие. Одним из предполагаемых механизмов являются возможные ошибки метилирования, возникающие уже на 6—8-клеточной стадии развития эмбриона [12—14].

При этом существуют четкие различия в реакции эмбриона на стресс. Стадии ооцита и дробления гораздо более уязвимы, чем таковые после компактизации [13] (рис. 3).

Однако с учетом необходимости оценки оплодотворения, а также с целью перехода на следующую ступень культивирования полностью отказаться от вторжений сложно.

По данным литературы, а также результатов этого исследования, пролонгированное культивирование эмбрионов до 5-х суток развития не оказывает негативного влияния на потенциал имплантации по сравнению с их культивированием и переносом на 3-и сутки развития. По мнению большинства авторов, результативность программ ЭКО значительно выше при переносе эмбрионов на 5-е сутки, что также свидетельствует об отсутствии неблагоприятного влияния длительного культивирования на эмбрионы.

Однако полученные нами данные показывают, что увеличение времени нахождения эмбрионов на 3-и сутки развития вне «идеальных» условий снижает процент бластуляции эмбрионов, а также влияет на ЧНБ, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста (статистическую достоверность данных осуществить не удалось в связи с малым числом пациенток). Эти результаты подтверждаются исследованиями, которые показывают увеличение толерантности эмбрионов к изменениям условий культивирования после стадии компактизации.

Существует несколько возможностей минимизации воздействия на эмбрионы — переход на одноступенчатые среды для культивирования, а также использование систем time-lapse микроскопии. Несмотря на все преимущества использования одноступенчатых культуральных сред, во-первых, они не имитируют изменения окружающей среды эмбриона при продвижении по маточным путям in vivo; во-вторых, в условиях непрерывного культивирования до 5-х суток развития происходит постепенное накопление продуктов распада протеинов при температуре 37 °C, включая аммоний [15—17], что приводит к изменениям экспрессии большого количества генов, вовлеченных в метаболизм клетки.

Безусловно, культивирование с использованием трехступенчатых сред является оптимальным вариантом, однако для минимизации нарушения «идеальных» условий стоит отказаться от дополнительной оценки эмбрионов на 3-и сутки развития.

1. Установлено, что частота наступления беременности при переносе эмбрионов на 3-и и 5-е сутки развития не отличается.

2. Проведение оценки качества развития эмбрионов на 3-и сутки не оказывает значительного влияния на ЧНБ и потенциал к имплантации. Однако более длительное пребывание эмбрионов вне инкубаторов при дополнительном анализе качества их развития на 3-и сутки оказывает влияние на количество полученных бластоцист, т. е. на процесс бластуляции эмбриона, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста.

Сведения об авторах

Краснопольская К.В. — д.м.н., проф., член-корреспондент РАН; e-mail: Ksu0207@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1275-9220

Бекетова А.Н. — к.м.н.; e-mail: nasti.b@hotmail.com; https://orcid.org/0000-0003-1415-7351

Сесина Н.И. — e-mail: sesina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7357-6682

Чинченко Н.К. — e-mail: nataliyachinchenko@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5552-9302

Бадалян Г.В. — e-mail: bgohar@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6636-979X

Сударикова Н.М. — e-mail: icing6131@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4584-8174

Бочарова Т.В. — e-mail: t.v.bocharova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3747-6067

Захарченко Е.О. — e-mail: Katerina-bio@ya.ru; https://orcid.org/0000-0001-6570-4525

*e-mail: Ksu0207@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1275-9220