Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Орлов В.И.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Погорелова Т.Н.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Гунько В.О.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Крукиер И.И.

Ростовский НИИ акушерства и педиатрии

Протеомный спектр амниотической жидкости при физиологической и осложненной беременности

Авторы:

Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Крукиер И.И.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2010;10(6): 4‑8

Просмотров: 355

Загрузок: 3

Как цитировать:

Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Крукиер И.И. Протеомный спектр амниотической жидкости при физиологической и осложненной беременности. Российский вестник акушера-гинеколога. 2010;10(6):4‑8.
Orlov VI, Pogorelova TN, Gun'ko VO, Krukier II. The amniotic fluid proteomic spectrum in physiological and complicated pregnancy. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2010;10(6):4‑8. (In Russ.).

?>

Современные высокотехнологичные методические подходы молекулярной биологии и медицины с использованием постгеномных технологий позволяют выяснить ранее неизвестные механизмы развития осложненной беременности. В последнее десятилетие интенсивное развитие начали получать технологии протеомного анализа, позволяющие изучить протеом - совокупность белков, экспрессируемых геномом исследуемого биологического объекта [1]. Белки, являясь «молекулярной машиной», которая реализует информационную программу клеток, играют ключевую роль во всех процессах, происходящих на молекулярном уровне в системе мать-плацента-плод (трофика плода, активный фетоплацентарный транспорт, антигенные взаимодействия между организмами матери и плода, межклеточные контакты, рецепция сигнальных биомолекул, ферментативные процессы и антиоксидантная защита плода). При срыве гомеостазирующих механизмов и развитии акушерской патологии в протеоме наступают вначале обратимые, а затем и необратимые нарушения, которые во многих случаях проявляются в изменении спектра и структурно-динамического состояния белков. Эти отклонения выражаются в появлении или исчезновении отдельных белковых фракций.

Важной биологической средой организма, быстро реагирующей изменением своего состава на патологические процессы, происходящие в организмах матери и плода, являются околоплодные воды, белки которых имеют как материнское, так и фетоплацентарное происхождение [3]. Протеомный анализ околоплодных вод может представлять весьма ценную информацию о течении беременности, состоянии плода и, как следствие, дает возможность прогнозировать состояние новорожденного.

В последние годы в литературе начали появляться работы по изучению протеомного состава амниотической жидкости, краткий обзор которых приведен в монографии В.И. Орлова и соавт. [3]. Однако в этих исследованиях отсутствуют сведения о динамике протеомного спектра при задержке роста плода (ЗРП), а данные при гестозе весьма малочисленны и относятся только к состоянию преэклампсии [13, 14]. В то же время указанные осложнения беременности до настоящего времени остаются ведущими акушерскими причинами, приводящими к пренатальной патологии [2, 4].

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение протеомного состава амниотической жидкости при физиологической беременности, ЗРП и гестозе для выявления белков-маркеров акушерской патологии.

Материал и методы исследования

В проспективное исследование были включены 42 женщины в возрасте от 23 до 33 лет (в среднем 25,7±0,4 года), составившие 3 группы. В 1-ю группу вошли 20 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов, во 2-ю - 10 женщин с асимметричной формой ЗРП на фоне плацентарной недостаточности; 3-ю группу составили 12 пациенток, у которых беременность осложнилась гестозом средней степени тяжести. Тяжесть гестоза оценивали по шкале C. Goeke в модификации Г.М. Савельевой. По возрасту, индексу массы тела, числу беременностей и родов в анамнезе, экстрагенитальной и гинекологической патологии обследуемые группы беременных были сопоставимы. Критериями исключения из исследования являлись декомпенсированные формы соматических заболеваний, тяжелые формы гестоза, антенатальная гибель плода, отсутствие информированного согласия женщины участвовать в исследовании. Материалом для исследования служили околоплодные воды, взятые при физиологической беременности и ЗРП во II триместре (23-26 нед) путем трансабдоминального амниоцентеза по акушерским показаниям и при вскрытии плодного пузыря в первом периоде родов (39-40 нед).

Все пациентки наблюдались в женской консультации по месту жительства и в консультативной поликлинике Ростовского НИИАП по программе «Акушерский мониторинг», предусматривающей расширенный протокол обследования во время беременности. Все пациентки были родоразрешены в родильном отделении института.

Протеомные карты амниотической жидкости получали с помощью двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле [15] по двум параметрам - электрическому заряду (IPG-стрипы pH 3-10, прибор Protean IEF Cell) и молекулярной массе (8-16% гель, прибор Protean II xi Multi-Cell). После завершения второго направления электрофореза для визуализации белковых пятен в гелях фореграммы окрашивали азотнокислым серебром, сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest. Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II с использованием программы Mascot MS Search и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Сравнительный анализ протеомных карт осуществляли по виртуальным интегрированным «мастер-гелям» двухмерных электрофореграмм (программа PDQuest) амниотической жидкости. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Jnc.) и Excel 2002. Достоверность различий между сравниваемыми группами для каждого белка отличия определяли с помощью критерия χ2 и четырехпольных таблиц сопряженности, используемых при анализе качественных признаков.

Протеомные исследования выполнены на базе отдела молекулярной биологии Института аридных зон ЮНЦ РАН.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что протеомный профиль околоплодных вод при физиологической беременности характеризуется значительной гетерогенностью (см. рисунок),

Рисунок 1. Протеомная карта («мастер-гель») околоплодных вод, взятых в первый период родов при физиологической беременности. Примечание. Нумерация белков соответствует таковой в табл. 1.
причем ряд белков (белки отличия) обнаруживается лишь в определенный ее период (табл. 1).
Сопоставление белкового состава амниотической жидкости в процессе развития неосложненной беременности позволило выявить 3 белка отличия, которые отсутствуют во II триместре и появляются в III триместре беременности: транстиретин, кальгранулин А (белок S100-A8) и кальгранулин B (белок S100-A9). Экспрессия транстиретина в период завершения беременности, очевидно, связана с процессами подготовки щитовидной железы плода к постнатальному функционированию, а появление кальгранулинов в этот период определяется их участием в процессах регуляции сократительной активности миометрия посредством Ca2+-зависимых реакций [9].

В околоплодных водах женщин с ЗРП во II триместре беременности отсутствуют 7 белков, характерных для аналогичного периода нормальной беременности, в числе которых идентифицированы 3: связывающий жирные кислоты эпидермальный белок, участвующий в регуляции трансмембранных процессов и клеточной дифференцировки [7], неферментативный антиоксидант гаптоглобин и антиоксидантный фермент пероксиредоксин-2 (см. табл. 1). Можно полагать, что нарушение синтеза этих антиоксидантов способствует усилению окислительных процессов и развитию оксидантного стресса, имеющегося при ЗРП на фоне плацентарной недостаточности [5]. Остальные 4 белка не удалось идентифицировать в связи с их недостаточным количеством для достижения чувствительности используемого масс-спектрометра.

Наряду с отсутствием в околоплодных водах во II триместре при ЗРП вышеуказанных белков выявлено появление 10 белков, отсутствующих при физиологической беременности, из которых идентифицированы 3: гиппокальцин-подобный белок-1 (нейрокальцин дельта), CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2. Появление этих регуляторных белков в околоплодных водах у женщин 2-й группы, по-видимому, имеет большое значение в механизмах развития данной патологии. Так, экспрессия NKG2D лиганда-2, усиливающего секрецию эмбриотоксических цитокинов, в частности фактора некроза опухолей, способна привести к активации апоптоза [8]. В то же время появление нейрокальцина дельта, участвующего в ингибировании нейронального апоптоза [10], можно рассматривать как компенсаторный процесс, предотвращающий переход апоптоза в апонекроз в структурах мозга плода. Аналогичную роль, по-видимому, играет появление CDC37-подобного белка, который контролирует смену фаз клеточного цикла и поддерживает пролиферацию [11].

В околоплодных водах, взятых при ЗРП во время родов, количество дополнительных белков по сравнению с таковым во II триместре беременности снижается в 2 раза. Из 5 появившихся белков идентифицированы 2 - NKG2D лиганд-2 и CDC37-подобный белок, которые обнаруживаются при ЗРП и во II триместре. Что касается нейрокальцина дельта, то этот регуляторный белок в отличие от II триместра отсутствует в конце беременности в околоплодных водах женщин 2-й группы. Количество отсутствующих белков к моменту родов, напротив, превышает их число в предыдущем триместре. Кроме вышеуказанных белков отличия II триместра, к их числу относятся транстиретин, кальгранулины А и B, которые и в конце гестации при ЗРП не секретируются в околоплодные воды, хотя в нормальном спектре они в этот период обнаруживаются.

Протеомный анализ околоплодных вод при беременности, осложнившейся гестозом, выявил отсутствие 10 белков, из которых идентифицированы 5: НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты, гаптоглобин, кальгранулины А и B (табл. 2).

Среди них следует особо выделить НАДФН-зависимую карбонилредуктазу, принимающую участие в регуляции окислительно-восстановительных реакций и энергетического обмена [12]. Модификация экспрессии этого фермента может нарушить указанные процессы, играющие важную роль в обеспечении нормального течения беременности и развития плода. Амниотическая жидкость при гестозе по сравнению с таковой при физиологической беременности содержит 7 дополнительных белков, в том числе С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы и белок-1, содержащий AIG2-подобный домен. Дополнительные белки в амниотической жидкости у женщин 3-й группы, появляющиеся при гестозе, очевидно, также имеют патогенетическое значение в развитии этого осложнения беременности. Так, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы репрессирует ген ядерного фактора NF-kB, ответственного за экспрессию антиапоптотических факторов, цитокинов и их рецепторов, ангиогенных факторов роста, ряда ферментов, в том числе NO-синтазы и циклооксигеназы [6]. Угнетение продукции этих биорегуляторов может способствовать запуску программы апоптоза в плаценте, накоплению реактивных форм кислорода, приводящему к развитию сидантного стресса. Появление в амниотической жидкости при гестозе мембраносвязанного белка, содержащего AIG2-подобный домен, свидетельствует о повреждении клеточных мембран в фетоплацентарном комплексе.

При анализе результатов исследования околоплодных вод, взятых во время родов, у женщин 2-й и 3-й групп обнаруживаются как общие изменения протеомного спектра по сравнению с таковым при физиологической беременности (отсутствие эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, гаптоглобина, кальгранулинов А и B), так и отличия: появление при ЗРП ряда белков, отсутствующих при гестозе, в их числе НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2. При беременности, осложнившейся гестозом, появляются белки, не выявленные при ЗРП: пероксиредоксин-2, транстиретин, С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие осложненной беременности происходит на фоне изменения продукции белков, участвующих в регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки и пролиферации, мембранного транспорта, поддержания про- и антиоксидантного баланса и других важных биологических процессов. Эти изменения, по-видимому, имеют патогенетическое значение в формировании осложнений беременности. Различие в протеомных спектрах, очевидно, определяет специфику развития акушерской патологии.

Таким образом, проведенные нами исследования расширяют представления о молекулярных механизмах развития ЗРП и гестоза, занимающих лидирующее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости. Выявленные белки отличия околоплодных вод могут быть использованы в качестве информативных маркеров акушерской патологии.

Выводы

1. Протеомный спектр околоплодных вод при акушерской патологии отличается от такового при физиологической беременности, причем разные осложнения гестации характеризуются определенной спецификой изменений.

2. В околоплодных водах при ЗРП выявлены и идентифицированы белки отличия, отсутствующие в разные периоды неосложненной беременности: нейрокальцин дельта (во II триместре), CDC37-подобный белок и NKG2D лиганд-2 (во II и III триместрах). К числу белков, не обнаруженных при ЗРП, в отличие от физиологической беременности, относятся кальгранулины А и В, транстиретин (в III триместре), гаптоглобин, пероксиредоксин-2 и эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты (во II и III триместрах).

3. В протеомном профиле амниотической жидкости при гестозе появляются 3 белка: С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы. В числе идентифицированных отсутствующих белков при гестозе - НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты, гаптоглобин, кальгранулины А и В.

4. При задержке роста плода в околоплодных водах, взятых в родах, отсутствуют 5 белков, обнаруженных при гестозе: пероксиредоксин-2, транстиретин, С-участок каппа-цепи иммуноглобулина, белок-1, содержащий AIG2-подобный домен, супрессор-1 метастазирования рака молочной железы.

5. В околоплодных водах при гестозе отсутствуют 3 белка, присутствующих при задержке роста плода: НАДФН-зависимая карбонилредуктаза-3, CDC37-подобный белок, NKG2D лиганд-2.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail