Введение

Несмотря на совершенствование методов клинической и лабораторной диагностики болезней пародонта, актуальной проблемой пародонтологии остается вопрос о применении и выборе методики антимикробной химиотерапии [1, 2]. В частности, постоянно корректируются показания для назначения химиотерапии с учетом степени тяжести, стадии, вариантов течения [3, 4]. Актуальны также и вопросы выбора системного или местного применения антибиотиков и других антимикробных препаратов, в том числе с учетом соотношения чувствительности и устойчивости (резистентности) основных пародонтопатогенных видов к тем или иным препаратам [5—7].

Резистентность бактерий к антибиотикам и различным антимикробным химиопрепаратам в последние десятилетия получила повсеместное распространение и расценивается ВОЗ как глобальная угроза. Поэтому совершенствование приемов выявления и идентификации штаммов с лекарственной устойчивостью, разработка соответствующих молекулярных технологий является важным направлением современной медицины. Вместе с тем, традиционные методы определения чувствительности к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, серийных разведений и другие) не позволяют расшифровать генетические механизмы, которые важны с точки зрения прогноза распространения лекарственной устойчивости в популяции [7].

Следует отметить, что в российской стоматологической практике серьезные исследования подобного рода начаты недавно и весьма немногочисленны [3, 8—10].

Цель исследования — установить распространенность штаммов микроорганизмов, резистентных к антибактериальным препаратам, выделенных из субгингивальных зубных бляшек больных пародонтитом в стадии обострения и ремиссии.

Материал и методы

Для исследования были отобраны пациенты, которым был поставлен диагноз: «хронический пародонтит» (K05.3) в результате клинического обследования и последующего лечения на базе Клинического центра стоматологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России и в стоматологических отделениях ЛПУ Москвы (№23, 29). Критерии включения (всего 90 человек): пациенты мужского и женского пола (43 и 47 человек соответственно) с числом присутствующих зубов ≥20 единиц, не включая третьи моляры и зубы с ортодонтическими приспособлениями, мостами, коронками или имплантатами. Средний возраст пациентов, участвующих в исследовании, составил 42,5±9,5 года.

Все пациенты подписали информированное согласие на проведение исследования. На основании критериев включения/исключения были сформированы три группы сравнения: 1-я — пациенты с хроническим пародонтитом в фазе обострения (обратились по поводу основного стоматологического заболевания); 2-я — пациенты с хроническим пародонтитом в фазе ремиссии (обратились по поводу проведения дентальной имплантации); 3-я — пациенты практически здоровые с интактным пародонтом (обратились по поводу лечебно-профилактических мероприятий).

С использованием современных методов выделения, культивирования и идентификации микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях [8, 9] проводили исследование следующих видов материала.

У каждого пациента до начала пародонтологического лечения отбирались образцы отдельных поддесневых биопленок с 4 выбранных лож с использованием стерильных микрощеточек. Посев проводили на 3 набора питательных сред: содержащих 2% триптиказо-соевого агара (BBL, Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA), 5% бараньей крови (Fazenda Pig, Rio de Janeiro, RJ, Brazil), 1% дрожжевого экстракта (BBL), 5 мг/мл гемина (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), 0,3 мг/мл менадиона К3 и 10 мг/мл азот-ацетилмурановой кислоты (Sigma), с добавлением 4 мг/мл тетрациклина HCl (Sigma) или без него. Образцы выдерживались в анаэробной атмосфере в течение 7—10 дней.

Исследование для определения чувствительного фенотипа осуществляли по стандартному протоколу диско-диффузионного метода Кирби—Бауэра. Концентрация культуральной взвеси составляла 108 КОЕ/мл по стандарту мутности MacFarland. Посев проводили «газоном» на специальную среду (Himedia Labs Ltd., Индия), для анаэробных бактерий пародонтопатогенной группы — с добавлением 5 об.% крови и стимуляторов роста (солянокислый гемин, менадион). Стандартные диски с антибиотиками наносили с помощью автоматического диспенсера в пластиковых чашках с указанной средой (диаметр 100 мм). Учет результатов проводили после инкубации в термостате при 37 °C 24 ч (для анаэробов — в анаэростате до 7 сут). Для быстрого учета результатов и документирования полученных данных использовали автоматический счетчик колоний Scan 500 (Interscience, Франция) с компьютерным сопровождением регистрации данных [9—11].

Для проведения данного исследования применяли традиционную постановку полимеразной цепной реакции в комплектации OneStep (НПФ «Литех», РФ) для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Взятие исследуемого материала и выделение ДНК проводили аналогично постановке ПЦР для выявления пародонтопатогенных бактерий. Осуществляли идентификацию генов хромосомных участков Mec, VanA, VanB, CTX-M, blaDHA, Cx-m, Erm, Mef.

Анализируемые пробы помещали в прогретый термоциклер — амплификатор «Терцик МС-2» («ДНК-технология», РФ) и осуществляли амплификацию по стандартным программам термоциклера: 93°, пауза; 93°, 30 с, 59°, 30 с, 72°, 30 с (35 циклов) на наличие генов — маркеров резистентности к цефалоспоринам CTX-M, blaDHA или 94°, пауза; 94°, 1 мин 30 с (1 цикл); 94°, 10 с, 64°, 10 с, 72°, 40 с (40 циклов); 72°, 2 мин (1 цикл) — к цефалоспоринам Mec A; ванкомицину и тейкопланину Van A и Van B [9, 12].

Результаты и обсуждение

Для оценки распространенности генетических маркеров резистентности в группах сравнения проводили идентичное исследование на предмет обнаружения R-генов с учетом результатов определения чувствительности диско-диффузионным методом. Учитывая клинические задачи, поставленные в нашей работе, мы использовали методику отбора штаммов, доминирующих по фенотипическим проявлениям устойчивости к следующим группам препаратов: бета-лактамным антибиотикам (ампициллин, амоксициллин/клавуланат), имидазолам (метронидазол), гликопептидам (ванкомицин) и тетрациклинам (доксициклин).

Это позволило дополнительно разделить R-штаммы одного вида, но различающиеся по фенотипическим проявлениям устойчивости, а затем проанализировать различия их индивидуальных генотипов — резистома (таблица).

Таблица. Количественная характеристика идентифицированных R-штаммов, выделенных от обследованных пациентов по группам

В качестве контролируемых генетических детерминант для оценки резистома были использованы Bla DHA — к пенициллинам, CTX-M и Mec A — к цефалоспоринам 1-го и 2-го типа, ErmB и Mef — к макролидам, линкосамидам и стрептограминам, Van A, B — к гликопептидам, Tet M, Q — к тетрациклинам, включая INT — плазмиды интегринов.

По данным диско-диффузионного метода определения чувствительности, среди альфа-зеленящих стрептококков S. sanguis из 25 штаммов выделили 7 чувствительных к аминопенициллинам и в 2,5 раза больше — устойчивых (18 штаммов), причем из них 4 штамма были устойчивы к бета-лактамазозащищенным препаратам (амоксициллин/клавуланат). Соответственно, среди фенотипически устойчивых штаммов определяли достаточно значительное количество генетических маркеров Bla DHA, CTX-M и Mec A, ответственных за резистентность к бета-лактамным антибиотикам. Однако среди них также определены генетические детерминанты, кодирующие устойчивость к макролидам, гликопептидам и в меньшей степени к тетрациклинам (Tet M и INT у 20—25% штаммов).

Сходная ситуация наблюдалась со штаммами Staphylococcus spp., однако их выделено в 6 раз меньше, чем стрептококков (только один штамм был фенотипически устойчивым к бета-лактамазозащищенным препаратам и у него определены детерминанты Bla DHA, CTX-M и Mec A).

Для анаэробных видов P. gingivalis, P. Intermedia, P. oralis основным фенотипическим признаком была резистентность к метронидазолу, которая выявлена в значительном числе случаев — примерно у 50% этих штаммов. В то же время у другой части штаммов (примерно у 20%) фенотипически выявлена устойчивость к аминопенициллинам (6 штаммов из 29). Примечательно, что у значительной части этих штаммов выявлены генетические маркеры резистентности Bla DHA, CTX-M и Mec A, ErmB и Mef, Van A, B и в меньшей степени к тетрациклинам (Tet M и INT, в основном у P. gingivalis). Это имеет принципиальное значение, так как P. gingivalis является основным пародонтопатогенным видом.

Что касается остальных видов, представленных в таблице, то они выделены в единичных случаях и довольно редко имели факторы резистентности (за исключением 2 штаммов Klebsiella spp. и 2 штаммов E. faecium).

Анализ частоты выявления генетических маркеров резистентности в целом показал, что наиболее часто из представителей микробиоты у пациентов данной группы выявляли маркеры ErmB и Mef, Van Ф, B (40—50%), а также Bla DHA. Выявление CTX-M, Tet M и INT находилось на среднем уровне (примерно у ¹/₃ штаммов). Минимальный уровень выявления генетических маркеров резистентности отмечен для маркеров Mec Ф и Tet Q (17,4%).

Во второй группе сравнения у пациентов с хроническим пародонтитом в стадии ремиссии выявлены схожие тенденции, которые, по-видимому, определялись частым и бесконтрольным использованием антибиотиков разных групп для лечения обострений в анамнезе. Вместе с тем выявлен ряд принципиальных отличий.

В частности, максимальный уровень выявления высокой частоты резистентности отмечен не только для Erm B и Mef, Van A, B, но также и для Bla DHA (40—50%). Напротив, довольно низкой была частота CTX-M и Mec A (10%), TetQ (20%).

Интересные результаты получены при анализе распространенности резистентности в 3-й группе у стоматологических пациентов с интактным пародонтом. Примечательно, что ни для одного из определенных генов не отмечено столь высокой частоты выявления, как в 1-й и 2-й группах (при хроническом пародонтите). Наиболее часто, у ¹/₃ пациентов, определяли генетические детерминанты Van A, B и Mef, несколько ниже — для Tet M и INT. Минимальная частота установлена для CTX-M и Mec A (4—6%), TetQ (2,3%).

Таким образом, можно сделать заключение, что практически здоровые пациенты с интактным пародонтом, которые не получали систематической антибактериальной терапии, существенно отличаются от двух предыдущих групп и частота выявления генов резистентности у них значительно ниже.

Полученные нами результаты согласуются с исследованиями, в которых было показано, что бактериальная нагрузка в субгингивальных биопленках у пациентов с хроническим пародонтитом была выше, чем у здоровых людей с интактным пародонтом [13—15].

С другой стороны, представляется, что амоксициллин/клавуланат наиболее эффективен для снижения доли устойчивых микроорганизмов, вероятно, из-за исключительно высокой концентрации антибиотика, создаваемой в пародонтальном кармане. Никаких значительных изменений доли тетрациклин-устойчивых микроорганизмов не наблюдалось в образцах поддесневых бляшек от пациентов, получавших только процедуру профессиональной гигиены с полировкой поверхности корней. Небольшое повышение наблюдалось через 3 мес, вероятно, из-за выбора и повышения доли стабилизирующих микроорганизмов, обычно устойчивых к тетрациклинам [1, 9, 14].

Хотя процентное соотношение всех устойчивых к тетрациклину стрептококков было одинаковым в сравниваемых группах субъектов (хронический пародонтит в фазе обострения и группа с интактным пародонтом), различия наблюдались на уровне видов S. sanguinis, S. oralis, однако роль этих видов при пародонтите в фазе обострения остается открытой [16—18]. Вместе с тем, известно, что альфа-зеленящие стрептококки составляют основу орального микробиоценоза в норме [18].

Изоляты родов Porphyromonas и Prevotella встречались с большей частотой в группе с хроническим пародонтитом в фазе обострения, чем в фазе ремиссии (в 2 раза), однако генетический профиль их резистентности был сходным. Вместе с тем, обнаружение хоть и немногочисленных, но устойчивых к тетрациклинам представителей этих видов, наблюдаемое преимущественно при хроническом пародонтите в стадии ремиссии, заслуживает упоминания, поскольку в большинстве отчетов основное внимание уделяется именно этим микроорганизмам [18—20].

Так, например, показано, что распространенность гена tet (M) среди практически здоровых людей в нашем исследовании была примерно в 2 раза ниже, чем было описано ранее [17, 20]. Тем не менее, распространенность этого гена при пародонтите в фазе обострения соответствовала тому, что другие авторы обнаружили у пациентов в Греции, США и Доминиканской Республике [17, 20, 21].

Выводы

1. Практически здоровые пациенты с интактным пародонтом, которые не получали систематической антибактериальной терапии, существенно отличаются от групп пациентов с хроническим пародонтитом (как в фазе обострения, так и ремиссии), и частота выявления генов резистентности у них значительно ниже.

2. Штаммы основных пародонтопатогенных бактерий Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia встречались с большей частотой в группе с хроническим пародонтитом в фазе обострения, чем ремиссии (в 2 раза), однако генетический профиль их резистентности был сходным. Вместе с тем, обнаружение хоть и немногочисленных, но устойчивых к тетрациклинам представителей этих видов, заслуживает внимания как возможный фактор последующей селекции и увеличения уровня устойчивости.

3. Генетические механизмы резистентности к цефалоспоринам и тетрациклинам, по-видимому, не были в достаточной степени реализованы у обследуемого контингента пациентов, страдающих хроническим пародонтитом. Особенно это касается относительно низкого уровня резистентности к тетрациклинам по сравнению с другими антибактериальными препаратами. Это является одним из аргументов для возвращения к схемам лечения с использованием доксициклина как одного из наиболее адекватных отечественных препаратов тетрациклинового ряда.

Исследование одобрено межвузовским этическим комитетом г. Москвы (протокол №13-20 от 2019 г.).

The study was approved by the Interuniversity Ethics Committee of Moscow (Protocol No. 13-20 of 2019).

Финансирование. В работе была использована инфраструктура Уникальной научной установки «Трансгенбанк» (НИИ биологии гена РАН).

Financing. The infrastructure of the Unique scientific installation «Transgenbank» (Research Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences) was used in the work.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.