Локальный цитокиновый профиль эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации и его фармакологическая коррекция секретомом мононуклеаров периферической крови

В программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у 60—70% женщин после переноса эуплоидного эмбриона хорошего качества беременность не наступает [1]. Репродуктивные неудачи могут быть связаны с материнскими и отцовскими факторами, качеством гамет и эмбрионов, особенностями образа жизни в сочетании с психологическим состоянием. Одной из вероятных причин, препятствующих имплантации, является дисбиоз полости матки [2]. Исследование микробиоты эндометрия в контексте бесплодия привлекает все больше внимания с позиций потенциальных возможностей терапии. Определение различных медиаторов воспаления в тканях и биологических жидкостях лежит в основе перспективного направления для диагностики локального воспаления [3]. Аномальная активация врожденного иммунитета эндометрия, стимулируемая различными патогенами, может представлять собой один из механизмов, в настоящее время недостаточно изученных, отрицательно влияющих на рецептивность эндометрия [4]. Имеются данные, позволяющие предположить, что цитокины, продуцируемые материнским эндометрием и развивающимся эмбрионом, играют основополагающую роль в этом процессе. Ряд исследователей отводят особую роль в успехе имплантации локальной иммунной толерантности, включающей в себя большое количество механизмов, в том числе продукцию цитокинов, интерлейкинов и факторов роста [5, 6]. Описаны изменения некоторых иммунных клеток, таких как нейтрофилы, макрофаги, NK-клетки и T- и B-клетки, тесно связанные с развитием эндометриоза, и как следствие реакция интерлейкинов и сдвиги экспрессии их рецепторов, что отражается на секреторных функциях эндометрия, ассоциированных с субфертильностью и бесплодием [7].

Субклиническое воспаление в тканях эндометрия протекает, как правило, локально, что определяет сложность выявления патогенетических факторов, низкую информативность и чувствительность традиционных методов лабораторной диагностики — исследования системного цитокинового профиля. Определение уровня специфических цитокинов и интерлейкинов может рассматриваться в качестве прогностических биомаркеров имплантации перед переносом эмбриона [8]. В преодолении инфекционного фактора в генезе имплантационных неудач современная терапия, направленная на элиминацию патогенов, далеко не всегда приводит к желаемому результату, и это означает необходимость новых подходов. Неудачи имплантации, вызванные иммунологическими факторами, можно контролировать с помощью инновационных методов лечения. Среди них внутриматочное введение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови [9]. Таким образом, иммуномодуляция эндометрия представляется как инновационный метод лечения для предотвращения повторных неудач имплантации при ВРТ.

Цель исследования — определить локальный цитокиновый профиль эндометрия у пациенток с многократными неудачными попытками ВРТ и эффективность его коррекции раствором лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови путем внутриматочной перфузии.

Дизайн исследования. С мая 2022 по сентябрь 2024 г. включительно проведено проспективное наблюдательное исследование по оценке локального цитокинового профиля до и после внутриматочного введения лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови в лечении пациенток с повторными неудачами имплантации в протоколах ВРТ. В исследование включено 55 пациенток в возрасте от 29 до 47 лет с наличием бесплодия в анамнезе более 5 лет и многократными неудачами ВРТ. Пациентки распределены в 2 группы. Основную группу составили женщины, у которых наступила беременность (беременность «+»), группу сравнения — женщины, у которых беременность в результате лечения не наступила (беременность «–»). После лечения у 14 человек повторно определен локальный цитокиновый профиль эндометрия.

Способ введения исследуемого препарата. Все женщины получали 10 внутриматочных введений лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови 1 раз в 3—5 дней за исключением периода менструации, в течение которого препарат не вводили. Перед введением разводили 2 официнальных флакона лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови (препарат Суперлимф) в дозе 200 мг в 1,0 мл воды для инъекций или в 1,0 мл физиологического раствора. Введение изготовленного раствора выполняли с помощью тонкого внутриматочного атравматичного катетера.

Критерии эффективности. Критериями эффективности проводимой терапии было наступление беременности в протоколе ВРТ или в протоколе переноса размороженных эмбрионов, а также наличие спонтанной беременности, зарегистрированной в течение 3—6 месяцев после прекращения введения исследуемого препарата в полость матки.

Описание исследования. До начала терапии у всех пациенток на 19—21-й день менструального цикла во время проведения гинекологического осмотра выполняли забор эндометрия с помощью атравматичного зонда. Часть полученного материала, предназначенного для оценки микробиоценоза с обнаружением возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, и вирусов, помещали в транспортную среду с муколитиком (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Другую часть биоматериала, необходимого для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа с применением теста ИммуноКвантэкс во избежание деградации РНК помещали в среду для стабилизации РНК в биопробах (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Для выделения ДНК из материала использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Для определения мРНК генов врожденного иммунитета проводили выделение нуклеиновых кислот с использованием набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с дальнейшим проведением реакции обратной транскрипции. Для постановки реакции использовали детектирующие амплификаторы DTprime 5 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Молекулярно-биологическое исследование микробиоты полости матки проводили с использованием тестов Фемофлор-16, ГерпесКомлекс, Квант 21, ХЛАМИ-ГЕН, ГОНО-ГЕН, EBV и HHV6 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). С помощью теста Фемофлор-16 определяли тотальную концентрацию бактериальной ДНК и концентрацию (абсолютную и относительную) следующих видов/родов микроорганизмов: Lactobacilluss pp., семейство Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae. Кроме того, оценивали абсолютную концентрацию Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Candida spp. и наличие/отсутствие Mycoplasma genitalium. Используя наборы реагентов ХЛАМИ-ГЕН, ГОНО-ГЕН, EBV и HHV6, определяли патогенные микроорганизмы (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae) и репродуктивно-значимые вирусы: вирус герпеса человека 6-го типа (HHV-6A), вирус Эпштейна—Барр (EBV). Используя мультиплексный тест «ГерпесКомплекс», определяли вирусы цитомегалии (CMV) и простого герпеса 1-го и 2-го типа (HSV1/2). Тест-система Квант 21 позволяла идентифицировать ВПЧ высокого (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82-й типы) и низкого (6, 11, 44-й типы) онкогенного риска.

Исследование уровней экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL-1B, IL-10, IL-18, TNF-α, TLR4, GATA3, CD68, B2M) с проведением объективной диагностики воспалительного процесса выполняли с помощью тест-системы ИммуноКвантэкс, позволяющей интегрально оценить уровень мРНК цитокинов и получить заключение о наличии локальной воспалительной реакции на основании автоматического расчета Индекса воспаления.

Статистический анализ. Проведено описание групп, а также сравнение частотных признаков между подгруппами по исходу беременности, выполнен анализ данных двух зависимых выборок до и после лечения. Качественные признаки представлены в виде абсолютных (количество) и относительных (доля/частота, в %) данных, количественные — в зависимости от варианта распределения признака в виде среднего значения и среднеквадратичного отклонения μ±SD (нормальное распределение) или в виде медианы с границами 25% и 75%-го перцентиля (отличное от нормального распределение). С учетом небольшой выборки вариант распределения признака в группе определяли критерии Андерсона—Дарлинга, Шапиро—Уилка. Значимость различий в подгруппах в зависимости от наступления беременности проверяли с учетом варианта распределения данных с использованием t-теста Стьюдента или U-критерия Манна—Уитни соответственно. Соотношение частот качественных признаков в подгруппах сравнивали с помощью теста хи-квадрат (χ²) Пирсона. Сравнение двух зависимых выборок проведено с использованием критерия t-Стьюдента и критерия Вилкоксона в зависимости от варианта распределения. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Этические правила и нормы. Исследование выполнено в полном соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи, а также другими регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. При соотношении пользы и рисков от режима внутриматочного введения исследуемого препарата учитывалась совокупная польза для участниц исследования с длительным бесплодием, заключающаяся в комплексной диагностике микробиоты полости матки, расчете индекса воспаления высокоинформативными методами, а также в ранее продемонстрированной эффективности внутриматочных инфузий лиофилизатом секретома мононуклеаров периферической крови в контексте наступления клинической беременности у пациенток с бесплодием и повторными неудачами имплантации.

В процессе проспективного наблюдения за 55 пациентками 31 (56,36%) женщина вступила в протоколы ВРТ, из которых 29 (93,54%) пациенткам перенесены размороженные эмбрионы. За период наблюдения, пока 24 (43,64%) пациентки ожидали вступления в протокол, в данной подгруппе диагностировано 11 (45,83%) случаев спонтанной беременности. Данные о частоте наступления беременности у женщин с длительным бесплодием представлены в табл. 1.

Таблица 1. Частота наступления беременности у пациенток, получивших комплексную терапию

Примечание. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; ВРТ — вспомогательные репродуктивные технологии.

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, у 2 (100%) пациенток, которым выполнен протокол ЭКО, наступила беременность, а из 29 женщин, которым выполнен перенос размороженных эмбрионов, беременность наступила у 18 (60%). Таким образом, беременность наступила у 20 женщин в результате процедуры ВРТ и у 11 спонтанно, что составило 31/55 (56,36%).

В результате сформированы 2 группы женщин: основная группа — 31 женщина, у которых наступила беременность (беременность «+»), и группа сравнения — 24 женщины, у которых беременность не наступила (беременность «–»). В табл. 2 представлены данные пациенток двух групп.

Таблица 2. Клинико-анамнестические данные пациенток обследуемых групп

Примечание. * — средние значения представлены в виде μ±SE (SD), где SE — стандартная ошибка среднего, SD — стандартное отклонение.

Как видно из данных, приведенных в табл. 2, все женщины были сопоставимы по возрасту, длительности бесплодия, социальному статусу, независимо от результата: наступления или отсутствия беременности в течение периода наблюдения.

Динамическое наблюдение за пациентками после завершения лечения, согласно протоколу, продолжалось от 8 до 57 недель.

Изучение гинекологического анамнеза пациенток с повторными неудачами имплантации показало отсутствие существенных различий по гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам у пациенток обеих групп. Данные анамнеза представлены в табл. 3.

Таблица 3. Гинекологический анамнез пациенток с повторными неудачами имплантации

Примечание. * — сравнение частотных признаков в подгруппах. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение.

При анализе микробиоты эндометрия установлено, что наиболее часто у женщин с бесплодием идентифицировались Lactobacillus spp. (n=44; 84,62%), Staphylococcus spp. (n=38; 73,1%), Atopobium vaginae (n=8; 15,38%), Eubacterium (n=7; 13,46%), Candida spp. (n=6; 11,54%). Доля остальных идентифицируемых микроорганизмов не превышала 5,77%. При последующем сравнении подгрупп в зависимости от наступления беременности значимых различий по микробному пейзажу полости матки не было.

При анализе вирусных агентов, обнаруженных в полости матки, выявлено 8 разных типов вируса папилломы человека (ВПЧ) у 12 пациенток, у 2 пациенток выявлен вирус герпеса 6-го типа, у 1 пациентки — вирус простого герпеса 1-го типа, в 2 случаях — цитомегаловирус и в 1 случае — вирус Эпштейна—Барр.

В результате анализа микробиоты эндометрия пациенткам с длительным бесплодием и при выявлении комменсальных микоплазм в эндометрии, кроме лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови, назначен доксициклина моногидрат в дозе 100 мг 2 раза в сутки 10 дней. При выявлении Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas и/или Fannyhessea vaginae (Atopobium vaginae) назначен моксифлоксацин по 400 мг 1 раз в сутки 10 дней. Пациентки, у которых обнаружены вирусы семейства Herpesviridae, получали валацикловир в дозе 500 мг 1 раз в сутки до момента наступления беременности. В табл. 4 представлены показатели локального цитокинового профиля эндометрия пациенток с бесплодием.

Таблица 4. Локальный цитокиновый профиль эндометрия пациенток обследуемых групп

Примечание.* — средние значения представлены в виде μ±SE (SD), где SE — стандартная ошибка среднего; SD — стандартное отклонение; ^# — распределение признака, отличное от нормального.

При анализе уровней экспрессии м-РНК генов врожденного иммунитета не установлены статистически значимые различия в подгруппах пациенток в зависимости от наступления беременности. У 14 пациенток с бесплодием в анамнезе проведен анализ экспрессии генов врожденного иммунитета до и после лечения. В табл. 5 представлен локальный цитокиновый профиль эндометрия пациенток с длительным бесплодием в анамнезе до и после лечения.

Таблица 5. Локальный цитокиновый профиль эндометрия пациенток с длительным бесплодием до и после комплексной терапии

Примечание.* — средние значения представлены в виде μ±SE (SD), где SE — стандартная ошибка среднего; SD — стандартное отклонение; ^# — распределение признака, отличное от нормального.

При анализе соотношений экспрессии генов врожденного иммунитета установлены значимые различия между показателями IL-18 и профилем IL-10/IL-18. Уровень IL-18 после лечения стал существенно выше по сравнению с показателем до лечения, что составило 3,8 [3,47; 4,07] и 3,3 [2,747; 3,5] соответственно, p<0,05. А соотношение IL-10/IL-18 до лечения составило 26,45 [21,64; 160,54], что выше по сравнению с показателем после лечения — 16,7 [10,45; 50,77], p<0,05.

Имплантация — это процесс, включающий в себя развитие, прикрепление и инвазию бластоцисты в эндометрий. Успех имплантации зависит от надлежащего взаимодействия эмбриона и эндометриальной ткани. Для достижения иммунной толерантности во время беременности важно наличие баланса между уровнями провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

В нашем исследовании при проведении контрольного анализа локального цитокинового профиля эндометрия у пациенток после комплексной терапии с внутриматочным введением аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови отмечено увеличение уровня экспрессии IL-18, который после лечения оказался выше по сравнению с показателем до лечения, что составило 3,8 [3,47; 4,07] и 3,3 [2,747; 3,5] соответственно (p<0,05). Q. Luo и соавт. (2006) отметили увеличение экспрессии IL-18 в секреторную фазу в эндометрии здоровых женщин при сравнении с женщинами с эндометриозом [10]. Показано, что IL-18 может обеспечивать защиту от патогенных микроорганизмов и модулировать локальную сеть цитокинов для инвазии трофобласта [11]. По данным многих авторов, при взаимодействии бластоцисты и эндометрия доминирует продукция провоспалительных цитокинов, в основном IL-1, IL-2, IL-12, IL-15 и IL-18, и специфических факторов роста (фактор роста эндотелия сосудов VEGF, и фактор ингибирования лейкемии LIF), которые незаменимы на ранних стадиях имплантации. Далее для поддержания беременности иммунный профиль эндометрия регулируется противовоспалительными цитокинами Th2 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 и GM-CSF) [12—15].

Результатом нашего исследования также стало изменение профиля противовоспалительных и провоспалительных цитокинов IL-10/IL-18. Этот показатель уменьшился после лечения: соотношение IL-10/IL-18 до лечения составляло 26,45 [21,64; 160,54], что выше по сравнению с показателем после лечения — 16,7 [10,45; 50,77], p<0,05.Полученный результат свидетельствует о значительном уменьшении выраженности воспалительного процесса в полости матки. Следует отметить, что нормально протекающая беременность, как правило, связана со снижением регуляции адаптационных процессов. Уже к моменту имплантации важна иммунологическая толерантность эндометрия, способного принять эмбрион. Сложно устроенная система защиты от отторжения плода является определенным регулирующим фактором в поддержании иммунологического баланса во время всего периода гестации [16].

В настоящее время описаны разные причины повторных неудач имплантации, которые в большинстве случаев связаны с совокупностью факторов, как микробных, так и иммунных. Предложено много вариантов лечения повторных неудач имплантации, имеющих неоднозначные результаты. В нашем исследовании после комплексной терапии лиофилизатом секретома мононуклеаров периферической крови (препарат Суперлимф) достигнут результат в виде повышения уровня экспрессии генов, кодирующих провоспалительный цитокин IL-18, который характерен для секреторной фазы, когда наблюдается максимальная толщина эндометрия. Нам также удалось добиться снижения выраженности воспалительной реакции эндометрия, о чем свидетельствует изменение профиля IL-10/IL-18. Данные показатели являются важными иммунологическими факторами, необходимыми для успешной имплантации.

Примененный нами препарат Суперлимф является иммуномодулятором, представляющим собой естественный комплекс природных противомикробных пептидов и цитокинов — универсальных стимуляторов иммунной системы, секретируемых лейкоцитами периферической крови свиньи. Обладает противовирусным, противомикробным и противогрибковым действием, стимулирует функциональную активность клеток фагоцитарного ряда (моноцитов и нейтрофилов): активирует фагоцитоз, выработку цитокинов (IL-1, TNF-α), индуцирует противоопухолевую цитотоксичность макрофагов, регулирует миграцию клеток в очаг воспаления, увеличивает активность естественных киллеров. Препарат обладает антиоксидантной активностью, снижает развитие воспалительных реакций, стимулирует регенерацию и эпителизацию. Нами уже описан успешный опыт применения естественного комплекса природных противомикробных пептидов и цитокинов (препарат Суперлимф) в комплексном лечении хронического эндометрита у пациенток с бесплодием. Добавление к противомикробной терапии локальной цитокинотерапии привело к более высоким показателям элиминации микробных агентов из полости матки и статистически значимо снизило степень выраженности хронического эндометрита [17].

Внутриматочное введение секретома мононуклеаров периферической крови потенциально показало себя как хороший способ модуляции восприимчивости эндометрия. При анализе соотношений экспрессии генов врожденного иммунитета установлены статистически значимые различия между показателями IL-18 и профилем IL-10/IL-18. Уровень IL-18 после лечения стал существенно выше по сравнению с показателем до лечения. Показатель соотношения IL-10/IL-18 после проведенного лечения значительно снизился.

Таким образом, стратегия в области иммунотерапии нуждается в дальнейшем изучении для лучшего понимания иммунотолерантности эндометрия матери к имплантации эмбриона. Коррекция иммунологических нарушений при имплантации эмбриона путем внутриматочного введения мононуклеаров периферической крови представляется многообещающим решением при повторных неудачах имплантации.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках ПНИ № 1024062500021-3-3.2.2 (FGWN-2024-0020).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.