Прогнозирование преэклампсии с определением четырех молекулярных подклассов omics

Преэклампсия (ПЭ) — это осложнение беременности, родов и послеродового периода, характеризующееся повышением уровня систолического артериального давления (САД) >140 мм рт.ст. и/или диастолического артериального давления (ДАД) >90 мм рт.ст. после 20-й недели беременности, независимо от уровня АД в анамнезе в сочетании с протеинурией (потеря белка >0,3 г/сут или >0,3 г/л в двух порциях мочи, взятых с интервалом 6 ч) или хотя бы одним другим параметром, свидетельствующим о присоединении полиорганной недостаточности [1].

ПЭ встречается в 3—8% случаев беременности и является основной причиной материнской и перинатальной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на достигнутые успехи в молекулярных исследованиях симптомов и клинических исходов, ранняя диагностика ПЭ должна быть изучена более глубоко.

Главной целью пренатального наблюдения являются выявление групп риска по развитию ПЭ и своевременная профилактика, что позволяет снизить материнские и перинатальные потери.

Из литературы известно о значительном прогрессе в понимании ПЭ с использованием клинической эпидемиологии, наблюдений клиницистов и молекулярно-генетических исследований. Развитие высокопроизводительных методов omics произвело революцию в подходах системной биологии к лечению заболеваний от молекулярного до клинического уровня [2]. Омиксные отрасли науки представляют собой различные дисциплины в биологии, в названиях которых имеется суффикс «-омик-», такие как: геномика, протеомика, метаболомика и транскриптомика. Усилия исследователей, работающих в указанных отраслях, направлены на детальную характеристику и количественную оценку пулов биологических молекул, изменения которых отражают структуру, функцию органов и систем, а также организма в целом, в том числе определяют клиническое течение различных заболеваний [3].

Новые подходы омиксных технологий и биоинформатики позволили рассмотреть ПЭ как гетерогенный синдром с множеством подтипов. Особое внимание при изучении ПЭ с использованием современных методов «omics» уделяется транскриптомике и протеомике.

Изучение протеомики материнской крови и плацентарной транскриптомики позволило выявить новые механизмы материнского и плацентарного взаимодействия, а также их влияния на клиническую картину ПЭ [2].

Комплексное геномное профилирование (технология, позволяющая изучать персональные мутации генов и способы управления ими) плацентарного транскриптома человека обеспечивает новый подход к изучению нормальной физиологии беременности и фетоплацентарного комплекса. Транскрипт — это молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции (экспрессии соответствующего гена или участка ДНК).

Транскриптом — это набор кодирующих (матричные РНК (мРНК)) и некодирующих (регуляторных) РНК, включая малые (микроРНК длиной 18—27 нуклеотидов) и длинные (примерно 200—300 нуклеотидов) некодирующие днРНК, которые присутствуют в клетке или ткани в различных физиологических условиях [4].

Для получения траскриптома плаценты используются два метода: микрочипы и секвенирование РНК. Микрочипы — это короткие олигонуклеотидные зонды, встроенные в чип. Каждый зонд имеет строго определенную последовательность нуклеотидов и место на микрочипе. При гибридизации происходит связь со специфическими последовательностями РНК или ДНК, что позволяет одновременно количественно оценивать многие транскриптомы генов.

Секвенирование РНК — это более новая, по сравнению с микрочипированием, технология получения транскриптом. Отличие секвенирования заключается в большей чувствительности метода, открывающего возможность рассмотрения более полной картины плацентарного транскриптома. Секвенирование помогает обнаруживать редкие и новые транскриптомы РНК, идентифицировать варианты как в кодирующих (кодирующей синтез белка), так и в некодирующих (регуляторных) РНК, а также выявлять и изучать РНК единичных клеток, тем самым рассматривать транскриптом конкретной клетки [2, 5, 6].

В обзоре литературы обобщены исследования плацентарного транскриптома человека от клеточного до тканевого уровня. H. Yong и S-Y. Chan систематизировали результаты 179 исследований, проведенных с 2004 г., по четырем направлениям, причем одно из них посвящено осложнениям беременности, включая ПЭ. Исследователи сосредоточили свой интерес на изучении плацентарного транскриптома III триместра беременности, полученного после родоразрешения. В результате исследований ученые обнаружили молекулярные паттерны, которые характерны для окислительного стресса и воспалительных реакций [7].

В исследовании, посвященном изменениям экспрессии генов в плаценте женщин I триместра, авторы провели сравнительный анализ образцов ворсин хориона, полученных в результате инвазивного скрининга беременных, у которых в дальнейшем развилась ПЭ [8]. Несмотря на небольшую выборку, исследование показало, что плацентация при ПЭ в I триместре связана с иммунными нарушениями в организме матери и плода, что ухудшает инвазию трофобласта [9].

Полученные результаты молекулярно-генетических исследований улучшили понимание физиологического развития плаценты. Кроме того, обнаружены биомаркеры, секретируемые плацентой и поступающие в материнский кровоток при ПЭ, например плацентарная растворимая fms-подобная тирозинкиназа 1-го типа (sFlt-1) и эндоглин (ENG) [10—12]. Проанализированы биологические процессы и соответствующие сигнальные пути, связанные с клиническими фенотипами ПЭ, что дало ключ к пониманию основных механизмов плацентарной патологии [7].

Методологической сложностью большинства исследований было отсутствие возможности учитывать клеточную гетерогенность плаценты. Плацента — гетерогенный орган с клетками различного происхождения, различной степени дифференцировки и, соответственно, с различными профилями экспрессии генов.

Известно, что снаружи ворсины плаценты покрыты цитотрофобластом и синцитиотрофобластом (клетки эпителиального происхождения), под которыми находится строма, образованная эмбриональной соединительной тканью мезенхимального происхождения, в которой проходят фетальные кровеносные сосуды. В строме ворсин присутствуют мезенхимальные стромальные клетки (включая телоциты, перициты, фибробласты), эндотелиальные клетки, а также плацентарные макрофаги (клетки Гофбауэра). Ранее макроскопические исследования плаценты не позволяли проанализировать патологические механизмы и получить недостающую информацию о молекулярных особенностях плаценты и анализе сигнальных каскадов. Развитие секвенирования РНК единичных клеток дало возможность понимания принципов молекулярного и межклеточного взаимодействия между разными типами клеток [13, 14].

Изучение транскриптомики раскрыло новые молекулярные подклассы ПЭ. K. Leavey и соавт. предположили, что ранее наблюдаемая гетерогенность клинических проявлений ПЭ приводит к отсутствию надежных прогностических биомаркеров и эффективных методов лечения патологии, обусловленному существованием нескольких молекулярных форм ПЭ [15, 16]. В зависимости от клинических проявлений ПЭ проведен анализ транскриптом плаценты и выделено пять кластеров пациенток. Первый кластер в основном включал пациенток, родоразрешенных в срок; второй кластер состоял преимущественно из пациенток с ранней манифестацией клинических проявлений ПЭ; в третий кластер вошли пациентки с ПЭ и другими осложнениями беременности; четвертый кластер состоял из пациенток со спонтанными преждевременными родами; пятый кластер включал женщин с плацентарными хромосомными аномалиями и с ПЭ [17, 18].

Выявленные в указанных исследованиях три основных подкласса ПЭ имели следующие характеристики. «Каноническая/плацентарная ПЭ» — клинически характеризовалась ранней ПЭ, хронической гипертензией, аномальной допплеровской велосиметрией, преждевременными родами, массой плода при рождении <50-го процентиля, синдромом HELLP, высокой экспрессией плацентарной sFlt-1 и ENG (биомаркеров, секретируемых в кровоток матери при ПЭ).

«Материнская ПЭ» — у пациенток этой группы ПЭ возникала при доношенной беременности. Как правило, это были первородящие с предшествующей артериальной гипертензией и невынашиванием беременности. Морфологические изменения в плаценте были минимальными [15]. Антропометрические показатели новорожденного соответствовали гестационному возрасту.

«Иммунологическая ПЭ» — у пациенток этой группы рождались недоношенные дети с гестационным возрастом от 30 до 36 нед беременности. Плацента имела малую массу, транскриптом отличался экспрессией генов, связанных с иммунным ответом (CXCL-10), а также с нарушением в системе фетоплацентарного кровообращения [15].

В дальнейших исследованиях проведена оценка гистологических изменений плаценты пациенток, принадлежавших к каждому выявленному молекулярному подклассу ПЭ, основанному на экспрессии генов. Авторы поставили цель проанализировать фундаментальные патофизиологические механизмы течения ПЭ. Молекулярные подклассы ПЭ определены путем интеграции данных об экспрессии генов и сопоставлены с гистологическими данными о плацентах. Полученные результаты продемонстрировали согласованность между поражением плаценты и экспрессией определенных генов разных вариантов ПЭ.

«Плацентарная ПЭ» была связана со слабой инвазией трофобласта, недостаточным ремоделированием спиральных артерий и ввиду этого со слабой плацентарной перфузией и ишемией плаценты. Отмечалась экспрессия плацентарной sFlt-1 и ENG.

«Иммунологическая ПЭ» характеризовалась хроническим воспалительным поражением ворсин плаценты, изменениями сосудов матери, межворсинчатыми тромбами, что приводило к неадекватной перфузии. При этом подклассе выявлена экспрессия генов, ассоциированная с провоспалительным типом иммунного ответа. Все это вызывало отторжение плода от организма матери как чужеродного объекта. Таким образом, имело место нарушение иммунологической толерантности.

«Материнская ПЭ» обычно не связана с поражением плаценты. При данном варианте течения ПЭ плацента практически не отличалась от таковой при неосложненной беременности [19].

Позже показано [20], что «иммунологическая ПЭ» ассоциирована с увеличением количества моноцитов (с положительным окрашиванием на CD68) и нейтрофилов (с положительной реакцией на миелопероксидазу) в межворсинчатом пространстве, в то время как при «канонической/плацентарной ПЭ» отмечено значительно меньшее количество таких клеток. Следует отметить, что сходные профили экспрессии генов плацент с «плацентарной ПЭ» и «иммунологической ПЭ» наблюдались и при задержке роста плода без ПЭ [21]. Это свидетельствовало о вовлечении общих сигнальных путей и показывало, что нельзя установить клинический кластер гипертензивных расстройств в плаценте только на основании анализа экспрессии генов. Плацентарные нарушения могли вызвать повышение уровня АД у женщины только в том случае, если организм матери восприимчив к патологическим изменениям плаценты. Некоторые женщины могли быть устойчивы к гипертоническому состоянию, вызванному дисфункцией плаценты. Материнские и фетальные факторы могли иметь разную степень участия в генезе ПЭ, поэтому ПЭ могла быть вызвана как одним из факторов, так и их сочетанием. Отмечено, что молекулярные изменения в материнской крови отражали изменения в материнском организме. Взаимодействие между плодом и организмом матери имело решающее значение для понимания нарушения перфузии плаценты, поскольку определяло развитие ПЭ и ее клинический фенотип [20].

Протеомика дает важную молекулярную информацию о здоровье матери и плода, открывает возможности в биомедицине для массового сравнительного анализа белкового компонента сложных биологических образцов. Протеомику можно определить как крупномасштабное исследование свойств белка: уровня его экспрессии, посттранскриптоционной модификации и взаимодействия белков для получения представления о процессах заболевания на уровне организма, ткани и даже одной клетки. В последние два десятилетия протеомика используется для описания белков, потенциально участвующих в патофизиологических механизмах ПЭ, а также для идентификации белковых биомаркеров и их модификаций, которые могут быть использованы в диагностике ПЭ.

В обзоре, проведенном в 2004 г., обобщены результаты 69 сравнительных исследований классов протеомики в связи с ПЭ, целью которых являлось изучение протеома материнской сыворотки, плаценты и мочи, что сделало его крупнейшим по сбору информационных данных. Авторы выделили потенциальные биомаркеры, которые описаны ранее в двух независимых исследованиях [22]. В последующем их разделили на три группы биомаркеров: в плаценте, сыворотке/плазме крови и моче. В плаценте описано 18 биомаркеров (табл. 1), в сыворотке/плазме крови — 29 (табл. 2), в моче — 16 (табл. 3).

Таблица 1. Биомаркеры плаценты

Таблица 2. Биомаркеры сыворотки/плазмы

Таблица 3. Биомаркеры мочи

Многочисленные исследования показали различный спектр экспрессии биомаркеров в биологических жидкостях при ПЭ (плаценты, сыворотки/плазмы крови, мочи) в сопоставлении с контрольными образцами. Ученые отмечали, что во всех трех группах (в крови, моче и плаценте) нет общего маркера, однако некоторые маркеры встречались в двух разных группах с разной экспрессией. Изменения уровней экспрессии некоторых белков зависело от рассматриваемой ткани или биологической жидкости.

Следует отметить, что ряд потенциальных биомаркеров выявлен у одних и тех же пациенток в различных биологических средах. Так, гамма-цепь фибриногена (FGG) при ПЭ характеризовалась снижением экспрессии в плаценте, но ее повышением в сыворотке/плазме крови. Исследователи предположили, что это могло быть связано с непрерывным высвобождением фрагментов поврежденных клеток из плаценты (например, ввиду ее ишемии) в плазму. Плазминоген выявлялся в плаценте и моче, при этом уровень экспрессии был выше в образцах ПЭ по сравнению с контрольными образцами. Альбумин при ПЭ характеризовался снижением экспрессии в плаценте и повышенной экспрессией в моче. Альфа-1-антитрипсин и трансферрин определялись как в моче, так и в сыворотке/плазме крови. При этом уровень их экспрессии был выше в образцах с ПЭ по сравнению с контрольными образцами. Ранее описана повышенная экспрессия эндоглина в сыворотке/плазме крови, сопровождающаяся снижением экспрессии плацентарного фактора роста, что указывало на нарушение ангиогенеза [23]. На это также влияла повышенная экспрессия фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа в плаценте при ПЭ, что, вероятно, связанно с увеличением в сыворотке/плазме крови растворимой формы sFLT1 [22].

Окислительный стресс играет ключевую роль при физиологическом и патологическом развитии плаценты. Авторы предположили, что при ПЭ образуется дисбаланс между антиоксидантными и проокислительными механизмами. Неполноценное ремоделирование спиральных артерий при ПЭ является основной причиной этого изменения.

Участвующие в защите клеток от токсического воздействия перекиси водорода и органических гидропероксидов каталаза и пероксиредоксин, по сравнению с контрольными образцами в плацентах, при ПЭ чаще повышены. Особый интерес вызывало, что в образцах сыворотки/плазмы крови у женщин с ПЭ была снижена экспрессия биомаркера с аналогичной функцией — глутатионпероксидазы 3.

Система комплемента имеет большое значение при врожденном иммунитете и воспалении, обеспечивая связь между врожденным и адаптивным иммунитетом. В нескольких исследованиях показана чрезмерная активация системы комплемента в плаценте при ПЭ [24]. Авторы отметили снижение экспрессии фактора комплемента B, субъединицы комплемента C1q B, комплемента C4B, SERPING1 и фиколина-2 в образцах сыворотки/плазмы крови ПЭ по сравнению с контрольной группой. Анализ образцов мочи выявил повышение уровня комплемента C3 при ПЭ по сравнению с контрольной группой [22].

Накопление конформационно измененных белков лежит в основе многих заболеваний, в том числе ПЭ [3]. В плацентах при ПЭ отмечалась повышенная экспрессия HSPB1. В то же время при сравнении образцов сыворотки/плазмы крови женщин с ПЭ и контрольной группы отмечалась пониженная экспрессия альфа-2-макроглобулина и PZP. Исследователи предположили, что снижение экспрессии PZP в сыворотке/плазме крови может способствовать накоплению конформационно измененных белков при ПЭ [25].

Изучение протеомики материнской крови позволило раскрыть новый молекулярный подкласс ПЭ (метаболический), что подтвердило существование ранее описанных молекулярных подклассов ПЭ. Проанализирован протеом у 82 женщин (22 — с ранней и 60 — с поздней манифестацией клинических проявлений) [26—28]. Известно, что масс-спектрометрия является высокочувствительной технологией количественного обнаружения белков. Учитывая данное обстоятельство, с помощью указанного метода проанализированы белки в образцах крови, в результате определены белки с малым содержанием аминокислот [26]. Оценены также современные биохимические и биофизические биомаркеры ПЭ. Для выявления подклассов авторы выполнили консенсусную кластеризацию (т.е. объединение противоречивых групп) [29].

Изучение белковых фракций пациенток показало необходимость их формирования в четырех отдельных кластерах.

Кластер 1 содержал случаи ранней ПЭ, задержки роста плода, хронической артериальной гипертензии, которые характеризовались патологическими допплеровскими индексами, нарушениями белкового профиля, признаками окислительного стресса и наличием антиангиогенного статуса. Такая клиническая картина указывала на подкласс «канонической/плацентарной ПЭ».

Кластер 2 содержал значительное количество случаев раннего начала ПЭ с нарушениями в материнском организме (высокий индекс массы тела (ИМТ), хроническая гипертония и сахарный диабет), самым высоким средним показателем уровня АД в I триместре и молекулярным профилем, соответствующим провоспалительным и сосудистым изменениям. Это, по мнению авторов, соответствовало новому подклассу ПЭ — «метаболический тип ПЭ» [30].

Кластер 3 включал в себя случаи с поздней манифестацией клинических симптомов ПЭ, обусловленные метаболическими нарушениями матери (высоким ИМТ, хронической гипертонией и сахарным диабетом), а также наличием эпизодов развития ПЭ в анамнезе, соответствующих системным провоспалительным изменениям, нарушению иммунологической толерантности, что определило «иммунологический» подкласс ПЭ.

Кластер 4 включал наблюдения позднего начала ПЭ, к которому относились женщины с доношенным сроком беременности. Состояние матери и плода на фоне минимальных изменений плаценты незначительно отличалось от контрольной группы, что соответствовало самому легкому варианту течения ПЭ — «материнскому» подклассу [26].

Исследование плацентарной транскриптомики позволило выявить три молекулярных подкласса ПЭ: «каноническая/плацентарная» ПЭ, «материнская» ПЭ и «иммунологическая» ПЭ. При изучении транскриптома отмечено, что профиль экспрессии генов имеет сходство с задержкой роста плода без гипертензивных нарушений [21]. Это позволило предположить, что изучение только транскриптома плаценты недостаточно для определения клинического варианта течения ПЭ.

Протеомное исследование материнской крови при ПЭ дает возможность рассмотреть изменения в материнском организме, что позволяет оценить плацентарные и материнские молекулярно-генетические особенности, определяющие развитие ПЭ и ее клинических вариантов.

Обращает внимание, что среди 18 потенциальных биомаркеров, изученных в образцах плаценты при ПЭ, выявлено устойчивое повышение экспрессии FlT1 и PAPPA2. Это подтверждает генетически обусловленную этиологию повышения АД при ПЭ [22]. В 29 биомаркеров в сыворотке/плазме крови при ПЭ обнаружена дисрегуляция ENG (повышение экспрессии) и фактора роста плаценты (PGF, снижение экспрессии), что доказывает системное антиангиогенное состояние при ПЭ [22].

Протеомные исследования выявили 4 отдельные группы пациенток с ПЭ, что подтвердило существование молекулярных подклассов ПЭ: «каноническая/плацентарная» ПЭ, «материнская» ПЭ и «иммунологическая» ПЭ, а также наличие нового «метаболического» подкласса. Авторами отмечено, что PGF, ранее использовавшийся в качестве «золотого стандарта» для оценки тяжести ПЭ и определения дальнейшей тактики ведения беременности, эффективен только для прогнозирования «канонической/плацентарной» ПЭ — единственного подкласса, в котором наблюдалось характерное снижение уровня PGF. У женщин этой подгруппы особенно эффективна профилактическая терапия аспирином [29, 30].

Использование других методов исследования, в том числе математического моделирования с применением искусственных нейронных сетей, например в оценке степени васкуляризации ворсинчатого дерева плаценты при ПЭ [31], позволит дополнить и уточнить указанную классификацию.

Технологии «omics» на основе молекулярного способа системной биологии подтверждают концепцию о том, что материнский и плодный факторы обладают определенной степенью независимости. По преобладанию одного из них выделены три механизма развития ПЭ: 1) влияние плацентарного фактора; 2) влияние материнского фактора; 3) синергия указанных факторов.

Следует отметить, что исследования плацентарной транскриптомики выявили три подкласса ПЭ в конце срока беременности, в то время как исследования протеомики показали, что в I триместре выделяются четыре подкласса с различными путями развития заболевания. Возможно, это связано с двумя исходными подклассами, например «плацентарными» и «метаболическими», которые в процессе прогрессирования ПЭ и нарастания клинической симптоматики достигают пиковых значений, становятся неразличимыми при анализе плаценты III триместра. Эти результаты имеют первостепенное значение для лучшего понимания ранних путей развития ПЭ. Полученные данные могут способствовать разработке новых диагностических инструментов, позволяют выявлять пациентов на ранней стадии ПЭ и наблюдать за ними, а также подбирать индивидуальную терапию аспирином или другие потенциальные профилактические методы лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.