Введение

Основные цели эмбриологической лаборатории заключаются в оптимизации условий культивирования и манипуляции с гаметами и эмбрионами, а также в оценке качества и выбора эмбриона для результативного переноса. Задача культивирования человеческих эмбрионов in vitro состоит в том, чтобы создать условия, максимально приближенные к их естественной среде. При традиционном способе культивирования чашки с половыми клетками и эмбрионами извлекаются из СО2-инкубатора для контроля морфологических изменений объектов под микроскопом. При этом в инкубаторе изменяются газовый состав, температура и относительная влажность [1, 2]. Считается, что это создает метаболический стресс [3—6], который может повлиять на развитие и качество эмбриона. Поэтому важно, чтобы время, затрачиваемое на работу с ооцитами и эмбрионами вне контролируемой среды инкубатора, было сведено к минимуму. С увеличением частоты культивирования бластоцист, когда эмбрионы содержат in vitro более длительный период времени, стабильность среды становится еще более важной.

Кроме того, статическая оценка «моментального снимка», проводимая вне инкубатора один раз в день в традиционной культуре эмбрионов, означает, что между этими временными точками не предоставляется никакой информации о развитии, и важные события могут быть упущены. В основном имеются ввиду аномальные клеточные деления, такие как прямое и обратное дробление бластомеров [7, 8]. Таким образом, при использовании только этих коротких статические оценок некоторые эмбрионы могут быть неправильно оценены и не должным образом ранжированы по качеству. В свою очередь, технология time-lapse (TLT) позволяет наблюдать процесс развития внутри инкубатора, сохраняя гомеостаз условий культивирования.

Преимущества непрерывного культивирования

Несколько исследований показали, что культивирование и обращение с эмбрионами в специализированных чашках и закрытых установках для покадровой съемки с захватом изображения, по-видимому, не ухудшают развитие эмбриона по сравнению с однотипными ооцитами, культивируемыми в обычной установке [9—11]. В то же время не было различий в частоте оплодотворения, качестве эмбрионов на стадии дробления или бластоцисты, а также в показателях продолжающейся беременности.

С точки зрения лабораторной логистики, у этой технологии есть определенные преимущества. TLT дает возможность документировать и оценивать морфологию эмбриона и время событий развития посредством отслеживания изображения в реальном времени. Это также дает возможность лучше изучить «поведение эмбриона» (например, неравномерное дробление) и проводить исследования, сравнивая, например, обмен веществ и условия окружающей среды (уровень кислорода, температуру, pH) с определением времени конкретных событий развития и с наступлением клинической беременности. Видео также позволяет сравнивать развитие эмбрионов в разных условиях, например, в различных питательных средах. Кроме того, если используются одношаговые питательные среды, эмбрионы можно держать внутри инкубатора непрерывно, начиная непосредственно после инсеминации in vitro инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ИКСИ) до дня переноса или криоконсервации. Таким образом, логистика лаборатории экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) упрощается и эмбрионы можно оценивать и классифицировать в любой момент времени в течение ежедневного рабочего процесса.

Внедрение систем покадрового мониторинга, в которых изображения эмбрионов снимаются с временными интервалами от 5 до 20 мин, привело к появлению новых способов работы и изменению рабочего процесса в лаборатории ЭКО. Технология включает в себя различные типы систем: чашки для культивирования, и камеры могут быть размещены либо как отдельная система внутри обычного инкубатора (открытая система), либо полностью интегрированы в меньший, обычно настольный, инкубатор (закрытая система). Таким образом, в условиях закрытой цейтраферной съемки инкубатор интегрирован с микроскопом, что обеспечивает стабильные условия культивирования, а также прямой просмотр в реальном времени и непрерывное документирование развития эмбриона.

Эмбрионы культивируются в специально разработанных чашках, разных для разных систем, и оцениваются внутри инкубатора через экран. Эмбрионы можно отслеживать в режиме реального времени и просматривать в конце периода культивирования в формате видеоролика, охватывающего все время развития. Различные системы покадровой съемки имеют разное программное обеспечение и основываются на различных алгоритмах [12]. Поэтому важно учитывать, что TLT в рамках вспомогательных репродуктивных технологий не является единой технологией, и прямое сравнение результатов не всегда возможно.

В проспективном сравнении инкубаторов COOK Minc и Vitrolife EmbryoScope, проведенном группой Y.H. Guo и соавт. [13], 600 пар пациентов рандомизированы в три группы: пациенты, чьи эмбрионы культивировались в инкубаторах Minc и отбор эмбрионов для переноса осуществлялся на основе стандартной морфологической оценки (CM); пациенты, чьи эмбрионы культивировались в EmbryoScope также со стандартной оценкой морфологии (TLM), и эмбрионы, культивируемые в EmbryoScope с оценкой морфокинетических параметров KIDScore Day 3 (TLA). В 424 циклах выполнен перенос двух эмбрионов в полость матки на 3-и сутки развития. Частота наступления беременности у женщин групп TLT оказалась статистически значимо выше, чем у женщин группы CM (CM — 65,2%, TLM — 77,2%, TLA — 81,3%). Частота имплантации и частота живорождений у женщин группы TLA (59,7 и 70,9% соответственно) были статистически значимо выше по сравнению с показателями у пациенток группы CM (47,7 и 56,1%). Статистически значимые различия между группами TLA и TLM (55,4 и 67,1%) не достигнуты. Между тремя группами не выявлены статистически значимые различия в частоте невынашиваний и эктопических беременностей. Масса тела новорожденных была статистически значимо выше у женщин групп TLT (CM — 2731,7±644,8 г, TLM — 3066,5±595,4 г, TLA — 2967,4±590,0 г).

Морфокинетика

Так называемые морфокинетические переменные представляют собой морфологические особенности и признаки дробления, зарегистрированные в точные моменты времени развития эмбриона, такие как появление и исчезновение пронуклеусов, деление клеток и образование бластоцисты [14]. Проанализирован большой массив данных, включая время определенных событий развития эмбриона [15—25], и их классификация с использованием индивидуальных покадровых морфокинетических характеристик для создания алгоритма оценки исходов (имплантация или живорождение). Ранние работы показывали, что прогностическая ценность этих алгоритмов довольно низкая, с уровнями AUC ниже 0,8 [16, 20—25]. Однако в исследовании 2019 г. D. Tran и соавт., в котором для создания и тестирования модели использованы цейтраферные видеоролики развития 8 836 эмбрионов, обнаружено, что алгоритм позволяет предсказывать клиническую беременность по цейтраферным видео с AUC 0,93 (95% ДИ 0,92—0,94) [26]. В исследование включены все циклы и эмбрионы (свежие, криоконсервированные, донорские), обработанные в течение периода исследования, показано, что модель глубокого машинного обучения может оценивать качество бластоцист. Будущие исследования могут уточнить модели, включив другие переменные, такие как день переноса эмбриона или возраст пациента. Например, Y. Liu и соавт. показано, что эмбрионы со сходной морфологией, но полученные от женщин разного возраста, демонстрируют разную частоту имплантации [27].

G. Coticchio и соавт. (2018) показали, что временные интервалы между четырьмя ранними морфокинетическими событиями предсказывают качество эмбриона на 3-й день [28]. Кроме того, сообщалось, что беспорядочное движение пронуклеусов в цитоплазме и замедленное исчезновение ядерных оболочек указывают на снижение потенциала развития эмбриона [29].

E. Soukhov и соавт. ретроспективно исследовали прогностический потенциал единственного морфокинетического параметра, а именно срока начала кавитации, для частоты имплантации 196 бластоцист 5-х суток культивирования, отобранных по морфологическим критериям [30]. Частота имплантации оказалась статистически значимо выше (58,8 и 42,6%, p=0,02) у эмбрионов с коротким интервалом от проведения ИКСИ до начала кавитации (78—95,9 ч) по сравнению с эмбрионами с более продолжительным интервалом (96—114 ч).

В другом исследовании, проведенном P. Khosravi и соавт., использовано более 12 000 изображений 877 эмбрионов хорошего и 887 эмбрионов плохого качества для реализации машинного обучения при выборе эмбрионов самой высокой категории [31]. Показано, что модель предсказывает развитие бластоцисты с AUC >0,98 и превосходит возможности отдельных эмбриологов. Разработано дерево решений, в котором модель оценивала качество бластоцисты, интегрированное с возрастом пациентки и связанное с исходом беременности. Анализ показал, что вероятность наступления бе-ременности зависела от качества бластоцисты, оцениваемой моделью, и возраста пациента, варьи-руя от 13,8% (возраст 41 год и старше и бластоциста низкого качества) до 66,3% (возраст младше 37 лет и бластоциста хорошего качества).

Модель глубокого обучения с высокой степенью надежности предсказывает вероятность наступления клинической беременности на основании данных видеозаписи развития эмбриона и возраста пациентки [26]. Для обучения модели использованы данные 8836 эмбрионов в 1835 циклах ЭКО, 1648 пациенток из 8 клиник. Площадь под кривой ошибок составила в среднем 0,93 (0,92—0,94).

B. Huang и соавт. изучали возможность прогнозирования эуплоидности эмбриона при помощи данных TLT. В рамках исследования для обучения и тестирования искусственного интеллекта биопсировали 1803 бластоцисты, данные о генетическом статусе образцов получены для 1779 из них: 617 (34,7%) — эуплоидные, 873 (49,0%) — анеуплоидные; 289 (16,2%) признаны мозаичными и исключены из модели обучения [32]. Обученная модель применялась для прогнозирования плоидности бластоцист. Площадь под кривой ошибок (AUC) прогноза, сделанного на основании единственного изображения бластоцисты, составляла 0,57. При использовании видео развития эмбриона, учете возраста пациентки, суток развития бластоцисты и морфокинетических данных AUC достигала 0,77, а при дополнительной обработке видео возрастала до 0,80.

N. Desai и соавт. обнаружили, что после поправки на возраст женщины поздние кинетические параметры tSB (время начала бластуляции), tEB (время начала расширения бластоцисты) и tEB—tSB (разница во времени между этими двумя событиями) были предикторами эуплоидии [33]. Вероятность эуплоидной бластоцисты была в 1,5 раза выше при tSB <96,2 ч. Кроме того, выбраковка эмбрионов с двумя или более дисморфизмами, такими как многоядерность или неправильный характер дробления, имела высокую прогностическую ценность.

В метаанализе, выполненном S. Armstrong и соавт., обобщены данные 9 рандомизированных контролируемых исследований по эффективности применения сочетания TLT и программного обеспечения для отбора эмбрионов по сравнению с традиционной инкубацией и морфологической оценкой [34]. Качество доказательств варьировалось от очень низкого до низкого. Авторы пришли к выводу, что недостаточно доказательств в различиях результатов по эффективности между этими двумя технологиями. В работе отмечено, что TLT и программное обеспечение выбора эмбриона могут снизить частоту выкидышей по сравнению с применением традиционной оценки по морфологии (N=1617; OR 0,63, 95% ДИ 0,45—0,89).

В двойном слепом рандомизированном контролируемом исследовании, изучающем покадровый алгоритм выбора бластоцист на 5-й день для переноса, опубликованном в 2022 г., частота развивающихся беременностей у женщин группы с применением TLT составила 47,4% (175 из 369) и 48,1% (181 из 376) у женщин контрольной группы. Между двумя группами не было статистически значимой разницы: средняя разница –0,7% (95% ДИ –8,2—6,7, p=0,90). Частота наступления беременности (60,2% по сравнению с 59,0%, средняя разница 1,1%, 95% ДИ –6,2—8,4, p=0,81) и преждевременных потерь беременности (21,2% по сравнению с 18,5%, средняя разница 2,7%, 95% ДИ –5,2—10,6, p=0,55) были одинаковыми у женщин группы TLT и контрольной группы [35].

Применение TLT при созревании яйцеклеток вне организма (IVM)

Ядерное созревание ооцитов состоит из двух стадий: стадия GV-MI, указывающая на возобновление мейоза, отмеченное исчезновением зародышевых пузырьков (GVBD), и стадия MI-MII, указывающая на созревание ядра, отмеченное экструзией первого полярного тельца (PB1). Применение мониторинга TLT позволяет регистрировать и оценивать динамику созревания ядер ооцитов во время процесса IVM [36]. Показано, что частота оплодотворения ооцитов, возобновивших мейоз в течение 8 ч и созревших в течение 24 ч, была значительно выше, чем у ооцитов, возобновивших мейоз и созревших позднее.

Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, в которых выявлено, что ооциты раннего созревания (18,4±2,7 ч) достигают более высоких показателей оплодотворения и развития, чем ооциты позднего созревания (26,3±3,8 ч) [37]. W.Y. Son и соавт. в исследовании также показали, что скорость дробления и развития бластоцист из ооцитов, созревших на 2-й день после IVM, была значительно ниже, чем у созревших на 1-й день [38]. Как эти, так и предыдущие исследования доказали ценность использования ооцитов, созревших в течение 24 ч после R-IVM.

Оптимизация времени ИКСИ важна для обеспечения наилучшего показателя оплодотворения в цикле IVM, поскольку большую роль играет контроль синхронизации между созреванием ядра и цитоплазмы, что достигается применением TLT. В контролируемой по времени когорте (n=57) самой результативной по оплодотворению и формированию бластоцист оказалась группа ооцитов, достигших стадии MII за 18 ч. Уровень оплодотворения был самым высоким, когда ИКСИ проводили между 5 и 6 ч после первой экструзии полярного тельца, n=17 (63%) [36, 39].

M. Dal Canto и соавт. продемонстрировали, что IVM не влияет на морфокинетику эмбриона [40]. Однако показано статистически значимое влияние эндометриоза на эмбриональную морфокинетику. Эмбрионы пациенток с эндометриозом демонстрируют замедленный клеточный цикл и сниженную частоту формирования бластоцист. N.C. Llarena и соавт. привели данные о морфокинетических событиях 3471 эмбриона. Показано более длительное по сравнению с контролем время достижения стадий 2—8 бластомеров (p<0,001), компактизации (p=0,015), формирования морулы и бластоцисты (p<0,001) у пациенток с эндометриозом [41].

На морфокинетические параметры эмбриона также негативно влияет высокий индекс фрагментации ДНК (DFI) сперматозоидов, что приводит к задержке клеточного дробления и бластуляции. Эмбрионы, полученные из образцов спермы с 30% и более DFI, показали более медленное дробление по сравнению с эмбрионами с менее 30% DFI (средняя разница составила 0,7 ч по времени появления пронуклеусов, 1,2 ч до исчезновения пронуклеусов, 1,5 ч до первого дробления, 2,7 ч по времени образования 8-клеточного эмбриона и 8,4 ч до начала бластуляции). Существенных различий в клинических исходах между группами не было [42].

По данным ООО МЦ «МирА» между группами пациентов, эмбрионы которых культивировались в EmbryoScope+, и пациентов с аналогичными параметрами из контрольной группы за тот же период 2021 г. не обнаружена статистически значимая разница. Частота оплодотворения эмбрионов, культивируемых в EmbryoScope+, составила 79,1% (596 из 753) и в контрольной группе — 77,5% (543 из 701). Доля эмбрионов, дошедших до стадии бластоцисты, составила в группах 60,9% (363 из 596) и 57,8% (314 из 543) соответственно. Частота наступления клинической беременности в «свежих» переносах у пациенток, чьи эмбрионы культивировались с применением TLT, составила 41,6% (10 из 24) по сравнению с показателем 2021 г., который составил 33,3% (24 из 72). По всем исследуемым параметрам культивирование в EmbryoScope+, оснащенном TLT, не выявило статистически значимой разницы, однако использование непрерывного мониторинга незрелых ооцитов, полученных в циклах IVM, позволило оптимизировать время оплодотворения (рис. 1—3). Поскольку время дозревания GV является важным показателем в прогнозировании потенциала развития ооцита, удалось оптимизировать время ИКСИ, что способствовало в дальнейшем получению более качественных эмбрионов. Кроме того, стало возможным выбрать оптимальный момент биопсии, применение TLT помогло избежать повреждения клеток во время лазерного хэтчинга перед проведением биопсии трофоэктодермы.

Рис. 1. Асинхронное исчезновение пронуклеусов.

Рис. 2. Дробление зиготы на три бластомера.

Рис. 3. Технология синхронного покадрового мониторинга позволяет фиксировать важные морфокинетические изменения.

Заключение

Несмотря на отсутствие в настоящее время данных о клинической пользе time-lapse технологии, закономерно было бы предположить, что по сравнению со статическими наблюдениями непрерывный мониторинг в стабильных условиях инкубатора даст больше информации о развитии эмбрионов и, как ожидается, повысит качество прогнозирования исходов. Time-lapse технология, с одной стороны, помогает обеспечить высокое качество условий культивирования половых клеток и эмбрионов, что позволяет достичь высоких значений частоты созревания бластоцист; с другой стороны, предоставляет морфокинетические данные, на основе анализа которых может быть сделан выбор эмбриона для переноса. В настоящее время продолжается процесс совершенствования морфокинетических критериев отбора, предлагаются различные прогностические модели. Time-lapse технология представляет собой отличный инструмент для обучения сотрудников эмбриологии и стандартизации оценки. Обмен базами морфокинетических данных между эмбриологическими лабораториями позволит создать более объективную модель прогнозирования и добиться максимальной эффективности программ экстракорпорального оплодотворения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.