Компаративная оценка провоспалительных цитокинов у женщин с диагностированными наследственными тромбофилиями различного генеза и их ассоциация с ранними и поздними эмбриональными потерями

Поиск и понимание механики прогностических факторов в нарушении материнско-фетальных взаимодействий, начиная с ранних сроков гестации, имеют большое значение для предупреждения и элиминации факторов, угрожающих нормальному течению беременности. Выявление биологических маркеров в отношении реализации патологических состояний при беременности является одним из резервов снижения частоты перинатальной заболеваемости и ранних репродуктивных потерь, не связанных с хромосомными аберрациями у плода [1—4]. Как известно, во время беременности происходит активация механизмов, отвечающих за создание благоприятного иммунологического фона для имплантации зародыша, роста и созревания плаценты, а также органогенеза у плода впоследствии [5]. В связи с этим сам процесс беременности рассматривается с точки зрения физиологически обусловленной толерантности иммунной системы матери к полуаллогенному плоду [6]. Поэтому любые осложнения и нежелательные исходы беременности, прежде всего, могут быть связаны с отклонением иммунной толерантности матери за счет изменений или сдвигов в продукции фетотрофических цитокинов.

Цитокины представляют собой короткоцепочечные пептидные информационные молекулы, являющиеся субпродуктами иммунокомпетентных клеток. Они выполняют регуляторную функцию, контролируют воспалительные реакции в организме, степень иммунного ответа, а также принимают участие в гемостазе и в поддержании микроциркуляции. Несмотря на то, что цитокины — следствие синтеза иммунных клеток, в то же время эти клетки сами служат мишенями для цитокинов [7]. Цитокины функционируют в качестве посредников межклеточных и межсистемных взаимодействий, участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма, которые на местном уровне запускают развитие воспаления. При несостоятельности местных защитных реакций цитокины способны запускать системное воспаление, что приводит к развитию острофазового ответа на уровне организма [8]. В норме при беременности соблюдается оптимальный баланс провоспалительных цитокинов, которые вырабатываются T-хелперами 1-го типа (Th1-клетки, Th1), и противовоспалительных цитокинов, вырабатываемых T-хелперами 2-го типа (Th2-клетки, Th2) в фетоплацентарном комплексе. Считается, что доминирование интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-4, ИЛ-10 также может приводить к рецидивирующему самопроизвольному прерыванию беременности [5, 9].

Иммунный ответ матери на трофобласт сдвигается в сторону более активного ответа через Th1-клетки. Многие из факторов, вырабатываемых Th1-клетками, присутствуют и при нормальной беременности, в течение которой умеренное системное воспаление усиливается по мере увеличения гестационного срока. Протектором от нежелательных последствий воспалительного процесса служит сложная материнская иммунорегуляция, которая в норме искажает иммунитет к гуморальным ответам, вызванным цитокинами 2-го типа, и от цитотоксических ответов 1-го типа, а также уравновешивает соотношение регуляторных T-клеток периферической крови.

Th1 вырабатывают интерферон-γ (ИФ-γ), ИЛ-2, ИЛ-3, факторы некроза опухоли (ФНО-α, ФНО-β), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), усиливающие клеточно-опосредованный иммунитет цитотоксического и воспалительного типа, направленный против вирусов, внутриклеточных патогенов и опухолей. Кроме того, Th1 активируют макрофаги. Избыточная выработка Th1-цитокинов играет важную роль в развитии аутоиммунных реакций. Th2 дифференцируются под действием ИЛ-4, который синтезируется дендритными клетками в ответ на поступление аллергенов, гельминтов, бактерий. Th2 синтезируют типичные для них цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ6-, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-21, ИЛ-23, ГМ-КСФ), индуцирующие развитие гуморального иммунного ответа. При избытке ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 развиваются аллергические реакции. Th1 и Th2 негативно регулируют активность друг друга. ИЛ-4 и ИЛ-10 подавляют функцию Th1, а ИФ-γ угнетает функцию Th2. Ниже приведена характеристика основных цитокинов в контексте воспалительного процесса при беременности и описаны «зоны» их ответственности.

ИЛ-1 синтезируется макрофагами, B-лимфоцитами, клетками эндотелия, фибробластами. ИЛ-1 стимулирует хемотаксис фагоцитов, вазодилатацию, синтез белков острой фазы, синтез простагландинов с последующим повышением температуры. Способен увеличивать пролиферацию и дифференцировку T- и B-лимфоцитов. В целом семейство цитокинов ИЛ-1 представляет особый интерес. Эти цитокины являются мощными компонентами врожденной иммунной системы, влияющими как на выживание, так и на гибель многих типов клеток и связывающими врожденные и адаптивные иммунные ответы. Они могут оказывать провоспалительное или противовоспалительное действие в зависимости от среды, в которой они действуют. Наиболее изученными при беременности являются провоспалительные цитокины ИЛ-1α и ИЛ-1β. Оба экспрессируются плацентой и секретируются эксплантатами плаценты in vitro в ответ на гипоксию. Экспрессия всех цитокинов семейства ИЛ-1 или регуляторных факторов обнаружена в большинстве из пяти клеточных линий трофобластов, что еще убедительнее подтверждает их происхождение из трофобластов. Следовательно, все известные члены семейства цитокинов ИЛ-1 экспрессируются плацентой при нормальной беременности, что подчеркивает сложную сеть регуляции цитокинов во время беременности.

ФНО-α синтезируется моноцитами/макрофагами. ФНО-α усиливает реакции воспаления: привлекает и активирует нейтрофилы, лимфоциты в очаг воспаления, усиливает синтез белков острой фазы. Обладает противовирусной и противоопухолевой активностью. В высокой концентрации вызывает «метаболическое истощение» (кахексию), развитие синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, септический шок.

ИЛ-6 синтезируется моноцитами/макрофагами, T-лимфоцитами. Экспрессия ИЛ-6 усиливается в завершающих этапах воспаления, то есть ИЛ-6 появляется позднее, чем ИЛ-1 и ФНО-α и ингибирует их секрецию. ИЛ-6 стимулирует синтез белков острой фазы воспаления, созревание гемопоэтических клеток, дифференцировку B-лимфоцитов в плазматические клетки, T-лимфоцитов — в ЦТЛ. Обладает противовирусной и противоопухолевой активностью.

ИЛ-8 синтезируется моноцитами/макрофагами, фибробластами, клетками эндотелия. Стимулирует хемотаксис нейтрофилов и других клеток в очаг воспаления, увеличивает выброс активных радикалов кислорода и других биоагрессиных веществ.

ИФ-α продуцируется моноцитами/макрофагами, B-лимфоцитами. Оказывает противовирусное и антипролиферативное действие, стимулирует NK-клетки, увеличиваетение синтез ИЛ-12 и Th1. ИФ-β синтезируется фибробластами, эндотелиоцитами, макрофагами. Эффект тот же. ИФ-γ синтезируется T-лимфоцитами, NK-клетками. Интерфероны активируют моноциты, макрофаги, NK-клетки, увеличивают образование оксида азота, внутриклеточный киллинг патогенов.

ИЛ-17 экспрессируется Th17, способствует увеличению продукции ИЛ-6, ИЛ-8, усилению миграции нейтрофилов, активизирует макрофаги, стимулирует фибробласты. ИЛ-18 синтезируется макрофагами, индуцирует выработку ИФ-γ, активирует NK-клетки.

Следует подчеркнуть, что Th1-клетки способны активировать сложный комплекс протромбиназы, который состоит из проакцелерина и фактора Стюарта—Прауэра, формирующийся на фосфолипидной поверхности мембран тромбоцитов в присутствии ионов кальция. А тромбоциты, в свою очередь, способствуют выделению и синтезу белка PAI-1 в эндотелии (белок, относящийся к группе сериновых протеаз, который снижает активность тканевого активатора плазминогена и урокиназы, участвующих во второй фазе фибринолиза), секретируя фактор роста тромбоцитов (PDGF-β) [10, 11]. Это значит, что профицит работы Th1-клеток ведет к тромбозам. Таким образом, при тромбофилии нарушается равновесное состояние между протромботической и фибринолитической активностью, что приводит к развитию протромботического состояния и эндотелиоза.

Роль наследственных тромбофилий в структуре причин патологии беременности составляет от 40 до 80% и рассматривается как этиопатогенетический фактор для широкого спектра заболеваний и синдромов (рис. 1) [12]. Нарушения гемостаза и гемореологии, характеризующиеся повышенной склонностью к развитию тромбозов или внутрисосудистого свертывания, называются тромбофилией. Среди форм генетической тромбофилии наиболее изученными являются дефицит антитромбина, дефицит протеина C и протеина S, лейденская мутация и мутация G20210A гена протромбина — их объединяют термином «классическая» генетическая тромбофилия. Зарубежные коллеги обсуждают целесообразность выявления только пяти основных «классических» тромбофилий, однако в России к значимым наследственным тромбофилиям, помимо «классических», относят еще и повышенный уровень фактора свертывания VIII (белок β-глобулин, который образует комплекс с фактором Виллебранда и синтезируется в эндотелиоцитах и печени) и гипергомоцистеинемию [13].

Рис. 1. Роль тромбофилий в патогенезе акушерско-гинекологической патологии (А.Д. Макацария, 2007¹).

ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; ЗГТ — заместительная гормональная терапия; СЗРП — синдром задержки развития плода; ПОНРП — преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты.

В акушерско-гинекологической практике при ведении пациенток с тромбофилией возникают трудности, потому что при наличии такого фактора повышается риск развития многих заболеваний. Причем данный риск сохраняется на протяжении всего периода беременности [12, 14, 15]. Именно поэтому в последнее время особое внимание уделяют изучению наследственно обусловленных нарушений в системе гемостаза у беременных женщин, а именно тромбофилий, которые являются одним из предикторов увеличения риска развития сосудистого тромбоза — ведущего этиологического фактора летальных исходов.

Цель исследования — оценить роль провоспалительных цитокинов и генетических факторов в развитии акушерских осложнений у женщин с наследственной тромбофилией.

Проведен ретроспективный анализ, в ходе которого изучены образцы ДНК 120 женщин репродуктивного возраста, живущих в Республике Дагестан (Российская Федерация). Обследованы 60 образцов ДНК женщин с наследственной тромбофилией и 60 образцов ДНК женщин без наследственной тромбофилии в анамнезе и нормально протекающей беременностью (контрольная группа). В основном исследуемую группу составили женщины с наследственной тромбофилией, находившиеся на лечении в стационаре ГБУ Республики Дагестан «Махачкалинский родильный дом №2 им. Р.А. Каримова» в связи с угрозой выкидыша.

На момент обследования женщины имели беременность различных сроков. У 38 (63,3%) женщин исследуемой группы в анамнезе самопроизвольные выкидыши наступали до 12 недель беременности, а у 24 (40%) — как до, так и после 12 недель беременности.

В нашем исследовании использовали следующие статистические показатели для нормального распределенного признака: среднюю арифметическую (M), стандартное отклонение (±SD), ошибку средней арифметической (±m). Для непараметрических количественных данных определены: медиана, квартили, 5-й и 95% процентили. Статистическая значимость различий выборочных данных при нормальном распределении с учетом равенства/неравенства дисперсий групп определена с помощью критерия Стьюдента (t) (для несвязанных выборок) и парного критерия Стьюдента (для связанных выборок). Различия считались статистически значимыми при p<0,05. При множественных сравнениях различия считались статистически значимыми при p<0,01 и меньше (применяли критерий Бонферрони). При малом числе наблюдений и непараметрическом их распределении для расчета статистической значимости эмпирических выборок использованы непараметрические методы статистической обработки: критерий Манна—Уитни (при несвязанных выборках) и Вилкоксона (при связанных выборках). Качественные и непараметрические количественные данные проанализированы при помощи критерия Фишера и χ2. Поправку Йейтса вводили при наличии ожидаемых значений менее 10. Оценка силы связи между признаками произведена по результатам корреляционного анализа с определением коэффициента корреляции Пирсона (r) (для нормального распределения) и коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R) (для непараметрических данных).

Все женщины дали письменное информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Исследование проведено с соблюдением условий добровольности и конфиденциальности.

Критерии включения в исследуемую группу: наличие выкидышей в анамнезе (2 и более); антенатальная гибель плода на поздних сроках беременности; поздний репродуктивный возраст.

Осложненный акушерско-гинекологический анамнез имели 45 (75%) женщин этой группы: это отслойка плаценты (40%), клинические признаки угрозы прерывания беременности (20%), хронический эндометрит (18,9%), фетоплацентарная недостаточность (10%), хроническое воспаление придатков матки (7,8%), задержка развития плода (2,2%), эрозия шейки матки (1,1%) (рис. 2). У исследуемых исключен антифосфолипидный синдром.

Рис. 2. Заболевания и патологические состояния у женщин исследуемой группы по данным анамнеза.

На момент обследования у 16 (26,67%) женщин выявили сопутствующую хроническую патологию в анамнезе: это гипофункция щитовидной железы (12,5%), гастрит, холецистит, панкреатит (23,2%), заболевания верхних отелов респираторного тракта (9,0%), пиелонефрит, мочекаменная болезнь (9,0%), ожирение (7,1%), сочетание (2—3) хронических заболеваний (30,2%) (рис. 3). Диагностические тесты методами ИФА и ПЦР показали, что 29 (48,17%) женщин из 60 являлись носителями половых вирусных инфекций (цитомегаловирус и/или простой герпес), 12 (20%) — носителями инфекции смешанного генеза (бактерии + вирусы), у 7 (11,3%) выявлен бактериальный вагиноз.

Рис. 3. Сопутствующие хронические заболевания у женщин исследуемой группы.

Средний возраст женщин в группе составлял 30,0±4,7 года.

Контрольную группу составили образцы ДНК 60 женщин, у которых во время настоящей и предыдущих беременностей отсутствовали спонтанные выкидыши, врожденные аномалии развития у плода (ребенка) и осложнения беременности. У 55 (91,6%) женщин беременность протекала физиологически. На момент обследования 49 (81,67%) женщин имели сопутствующую хроническую патологию, которая включала: заболевания пищеварительного тракта (16,3%), заболевания мочеполовой системы (16,3%), заболевания верхних отделов респираторного тракта (14,3%) и сочетание 2—3 хронических заболеваний (48,9%). По данным диагностических тестов методами ИФА и ПЦР, 14 (23,33%) женщин являлись носительницами половых вирусных инфекций: 5 (8,33%) — половых инфекций смешенного генеза, 12 (20%) женщин имели бактериальный вагиноз. Средний возраст женщин в группе — 28,9±4,3 года.

Выявлено, что дисбаланс в системе провоспалительных и противовоспалительных цитокинов с профитом в сторону первых на фоне наследственной тромбофилии вызывает эндотелиальную дисфункцию во время беременности. Эти факторы могут оказаться достоверными кандидатами в биомаркеры акушерских и перинатальных осложнений у беременных с тромбофилией.

В таких условиях во время беременности формируется провоспалительный статус, который характеризуется повышением уровня лейкоцитов в крови, C-реактивного белка, которые являются биомаркерами хронического воспаления. Происходит гиперпродукция специфических и неспецифических медиаторов воспаления: комплемента, лейкотриенов, простагландинов, простациклина, основных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-6 и др.), гистамина, клеточных адгезивных молекул (ICAM-1, VCAM-1), фактора активации тромбоцитов, токсических метаболитов кислорода и других свободных радикалов, что дополнительно приводит к активации системы гемостаза на фоне эндотелиальной дисфункции [9, 16]. У женщин с разными видами тромбофилии в исследуемой группе обнаружены полиморфизмы генов провоспалительных цитокинов (IL1B 31T/C, CD46 5032 C/G, IL6 174 G/C, TNFA 308G/A и др.), что сочеталось с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов [17]. Повышение концентрации упомянутых выше биомаркеров может приводить к нарушению реологических свойств крови и снижению фибринолитической активности организма, что сопряжено с повышением тромбогенного потенциала к созданию гиперкоагуляционного фона. Определенное значение в увеличении концентрации фибриногена в крови при беременности придается влиянию повышенного количества ИЛ-6, выделяемого активированными моноцитами и гладкомышечными клетками. Способствующим тромбообразованию фактором является усиление реакции высвобождения из активированных тромбоцитов тромбоксана А2 и тромбоцитарного фактора роста, влияющих как на состояние сосудистой стенки, так и на гемокоагуляцию (табл. 1—3).

Таблица 1. Праймеры и зонды для определения нуклеотидной последовательности полиморфизма в генах TNFA (rs361525), IL10 (rs1800896) и IL1B (rs1143634)

Таблица 2. Сравнительная характеристика исследуемых групп

Примечание.* —p-value оценивали с помощью бинарной логистической регрессии.

Таблица 3. Ассоциации полиморфизма генов цитокинов у женщин с наличием самопроизвольных выкидышей (3 и более) в анамнезе

Примечание. * — cor — p-value с учетом коррекции по Бонферрони (количество тестов равно 10).

Нами обнаружено, что при тромбофилии активируются не провоспалительные цитокины семейства ИЛ-1, а регуляторные рецепторы или противовоспалительные факторы, которые экспрессируются на более высоких уровнях в плаценте. Это принципиально новая информация, так как принято считать, что плацента оказывает провоспалительное действие при тромбофилии, но мы обнаружили только усиление действия двух противовоспалительных факторов. Похоже, что плацентарные механизмы подавляют чрезмерное системное воспаление при тромбофилии как протектор.

Ассоциации полиморфизма в генах цитокинов с тромбофилией у женщин изучены неоднократно. Однако результаты исследований в популяциях не всегда однозначны. Поэтому целью данной работы явилось изучение ассоциаций полиморфизма генов цитокинов IL1B (rs1143634), TNFA (rs1800629, rs361525), IL6 (rs1800795) с тромбофилией у женщин.

Анализ результатов проведенных исследований позволяет заключить, что функциональные трансформации иммунной системы матери во время беременности характеризуются высоким уровнем реактивности в ответ на сильные раздражители, в частности, постоянной готовностью включения Th1-пути при воздействии дополнительной нагрузки. Оценка функционального резерва иммунокомпетентных клеток в экспериментальных условиях в ранние сроки беременности представляет собой дополнительный инструмент прогнозирования гестационных осложнений и оценки целесообразности прерывания беременности на ранних сроках гестации.

Нами также обнаружено, что при тромбофилии активируются не провоспалительные цитокины семейства ИЛ-1, а регуляторные рецепторы или противовоспалительные факторы, которые экспрессируются на более высоких уровнях в плаценте, после чего нами сделан вывод, что плацентарные механизмы подавляют чрезмерное системное воспаление при тромбофилии как высокоточный протектор.

Оценивая полученные данные, можно заключить, что полиморфизм генов IL1B (rs1143634), TNFA (rs1800629, rs361525) у женщин оказывает влияние на развитие акушерских осложнений, таких как угроза самопроизвольного прерывания беременности, раннего и позднего токсикоза беременных, невынашивание беременности. Полученные результаты могут быть полезными в понимании молекулярных механизмов неблагоприятного течения беременности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors declare lack of the conflicts of interests.

¹Макацария А.Д. Бицадзе В.О., Акиньшина С.В. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике: молекулярно-генетические механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей. М.: Медицинское информационное агентство; 2007.