Введение

Кровотечение из варикозно расширенных вен пищевода (ВРВП) является одним из наиболее опасных осложнений синдрома портальной гипертензии, наиболее частой причиной которого считают цирроз печени (ЦП). Распространенность ВРВП у пациентов с ЦП варьирует от 30% до 70%, варикозное расширение вен «высокого риска» наблюдается у 9—36% пациентов. Сообщается, что ВРВП развиваются с ежегодной скоростью примерно 5—8%, а небольшие ВРВП прогрессируют до крупных узлов со скоростью примерно от 4% до 30% в год, что создает высокий риск развития кровотечений [1].

В качестве первичной и вторичной профилактики кровотечений из ВРВП портального генеза на протяжении длительного времени используются неселективные β-адреноблокаторы (β-АБ) [2]. Однако ответ на терапию у пациентов с ЦП варьирует и не всегда предсказуем, что может приводить к недостаточной коррекции портальной гипертензии и, как следствие, к развитию кровотечений из ВРВП [3—5]. По этой причине поиск маркеров, позволяющих прогнозировать ответ на лечение неселективными β-АБ, является актуальной проблемой, которая обусловливает необходимость проведения дополнительных исследований.

Цель исследования — оценить ассоциацию полиморфных маркеров rs1042713 и rs1042714 гена β2-адренорецептора (ADRB2) с ответом на пероральный прием пропранолола при коррекции портальной гипертензии у пациентов с циррозом печени.

Материал и методы

В проспективное когортное исследование включено 47 пациентов с ЦП различной этиологии, из них 30 (63,83%) мужчин и 17 (36,17%) женщин. Медиана возраста составила 57,0 года (95% ДИ 52,95—61,68). Все участники относились к европеоидной расе, не состояли в родстве и постоянно проживали на территории Республики Беларусь. В структуре этиологии ЦП преобладали вирусные формы; реже встречались криптогенный вариант, алкогольное поражение печени, первичный билиарный холангит и смешанные формы.

Исследование проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено локальным этическим комитетом УО «Гомельский государственный медицинский университет» (протокол №4 от 17.12.2018). До включения в исследование у всех пациентов получено письменное информированное добровольное согласие.

Критерии включения: подтвержденный диагноз ЦП любой этиологии, возраст менее 75 лет, европеоидная раса, отсутствие родственных связей с другими участниками, постоянное проживание на территории Республики Беларусь, подписанное информированное добровольное согласие на участие и обработку персональных данных.

Критерии невключения: острая печеночная недостаточность, клинически значимые заболевания сердца, легких или почек, злокачественные новообразования, тяжелые заболевания головного мозга, метаболическая или токсическая энцефалопатия, прием глюкокортикоидов или иммуносупрессивных препаратов в течение месяца до скрининга, противопоказания к назначению β-адреноблокаторов, беременность и отказ от участия.

Диагноз ЦП устанавливали по результатам стандартного клинического и лабораторно-инструментального обследования согласно клиническому протоколу «Диагностика и лечение пациентов с заболеваниями органов пищеварения», утвержденному постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 01.06.2017 №54 [6].

Степень тяжести ЦП оценивали по шкале Чайлда—Пью с учетом уровней билирубина и альбумина, международного нормализованного отношения (МНО) или протромбинового индекса, выраженности асцита и печеночной энцефалопатии, в том числе по результатам теста соединения чисел. Для выявления ВРВП проводили эзофагогастродуоденоскопию. Степень ВРВП определяли по классификации А.Г. Шерцингера (1986): I степень — диаметр вен до 3 мм; II степень — 5—10 мм; III степень — более 10 мм [7].

Пропранолол назначали внутрь однократно утром в дозе 40 мг. До и через 2 часа после приема препарата измеряли артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) [8, 9]. «Ответчиками» считались пациенты со снижением ЧСС ≥25% от исходного уровня либо до 55 уд/мин при исходно низкой ЧСС, что соответствует снижению градиента печеночного венозного давления ниже 10 мм рт.ст. и ассоциировано с уменьшением риска кровотечения. При снижении ЧСС менее 25% пациенты классифицировались как «неответчики» [6, 10, 11].

Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов rs1042713 (Arg16Gly) и rs1042714 (Gln27Glu) гена β2-адренорецептора выполняли методом полимеразной цепной реакции с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Ожидаемый размер ампликонов составлял 201 п.н. для Arg16Gly и 353 п.н. для Gln27Glu. Последовательность праймеров представлена в табл. 1.

Таблица 1. Нуклеотидная последовательность праймеров

Расчет объема выборки выполнен с использованием программы G*Power (версия 3.1). При частоте редкой аллели в европейской популяции 0,37, мощности исследования 0,80 и уровне значимости α=0,05 минимально необходимый объем выборки составил 47 пациентов.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета программ Statistica 10.0 («StatSoft Inc.», США), лицензионный номер 12334567. Для проверки нормальности распределения использован тест Шапиро—Уилка. Вследствие ненормальности распределений количественные показатели описаны в виде медианы (Me) и 95% доверительного интервала (95% ДИ). Качественные показатели представлены в виде абсолютных и относительных частот. При сравнении трех и более независимых групп по качественному (бинарному) признаку использовали критерий трендов Кохрана—Армитажа, попарное сравнение осуществлялось с применением двустороннего критерия хи-квадрат (χ²) или при количестве наблюдений ≤5 точного критерия Фишера. При сравнении 3 и более независимых групп по количественному признаку применялся критерий Краскела—Уоллиса, при попарном сравнении — критерий Манна—Уитни. В качестве специализированного непараметрического post-hoc теста использовали тест Коновера. Сравнение двух связанных совокупностей проведено с применением критерия Вилкоксона. Для выявления связи между определенными исходами и факторами риска использовали отношение рисков (ОР) и 95% ДИ для ОР. Различия считали достоверными на 5%-м уровне значимости или при p<0,05.

Результаты

На первом этапе проведен анализ гаплотипического разнообразия гена ADRB2 у пациентов с ЦП. Установлено, что наиболее распространенными были гетерозиготные варианты гаплотипов, выявленные у 51,06% пациентов (n=24). Гомозиготные варианты Gly16-Glu/Gln27 встречались реже — у 36,17% (n=17) пациентов. Наименее распространенным оказался гаплотип Arg16-Gln27, обнаруженный в 12,77% случаев (n=6).

На втором этапе выполнено сравнение основных характеристик групп пациентов с ЦП в зависимости от геномных различий. Существенных различий в исходных характеристиках групп пациентов с разными гаплотипами гена ADRB2 не было (табл. 2).

Таблица 2. Взаимосвязь клинико-лабораторных и инструментальных характеристик пациентов с циррозом печени с различными вариантами гаплотипов гена ADRB2

Примечание. Здесь и в табл. 3, 4: Данные представлены в виде абсолютных величин, медианы и 95% доверительного интервала Me (95% ДИ).

На третьем этапе выполнен анализ распределения пациентов с ЦП с разными гаплотипами гена ADRB2 в зависимости от ответа на прием пропранолола (табл. 3).

Таблица 3. Распределение пациентов с циррозом печени с разными гаплотипами гена ADRB2 в зависимости от ответа на прием пропранолола

Как видно из табл. 3, ответ на прием пропранолола у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27 был значительно выше, чем у носителей гомозигот Arg16-Gln27 (p=0,048) и комплексных гетерозигот (p=0,048).

На четвертом этапе проведена оценка гемодинамических показателей (среднего АД (АДср) и ЧСС) у пациентов с ЦП с разными гаплотипами гена ADRB2 до и после приема пропранолола (см. табл. 3, табл. 4).

Таблица 4. Анализ динамики частоты сердечных сокращений у пациентов с циррозом печени с разными гаплотипами гена ADRB2 до и после приема пропранолола

Примечание. p* — для критерия Краскела—Уоллиса; p** — для критерия Вилкоксона; p*** — для критерия Манна—Уитни.

Какие-либо различия в частоте ЧСС как до, так и после приема пропранолола у носителей всех трех гаплотипов не наблюдались (см. табл. 4).

В то же время, как видно из табл. 4, прием пропранолола (40 мг внутрь однократно) привел к существенному снижению ЧСС у носителей всех трех гаплотипов (p<0,05). Однако степень снижения ЧСС (∆ЧСС, %) была выше у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27 в сравнении с носителями гомозигот Arg16-Gln27 (p=0,01) и комплексных гетерозигот (p=0,03).

Уровни АДср как до, так и после приема пропранолола у носителей всех трех гаплотипов не имели существенных различий (табл. 5).

Таблица 5. Анализ динамики среднего артериального давления у пациентов с циррозом печени с разными гаплотипами гена ADRB2 до и после приема пропранолола

Примечение. АДср — среднее артериальное давление. p* — для критерия Краскела—Уоллиса; p** — для критерия Вилкоксона.

Тем не менее, как видно из табл. 5, прием пропранолола (40 мг внутрь однократно) привел к существенному снижению уровня АДср только у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27 (p=0,002) и комплексных гетерозигот (p=0,0002). У носителей гомозигот Arg16-Gln27 не было значительного снижения уровня АДср (p=0,35). Кратность изменения АДср у носителей всех трех гаплотипов не имела существенных различий (p=0,10).

На заключительном этапе произведена оценка относительного риска (ОР) ответа на прием пропранолола (наличие или отсутствие эффекта) в коррекции портальной гипертензии у пациентов с ЦП, ассоциированного с гаплотипами гена ADRB2.

Как видно из табл. 6, вероятность оказаться «ответчиком» на лечение пропранололом статистически значимо (p=0,01) возрастала более чем в 3 раза у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27. Вероятность принадлежности к «неответчикам», наоборот, возрастала в 1,5 раза у носителей гомозигот Arg16-Gln27 (p=0,0002).

Таблица 6. Относительный риск ответа на прием пропранолола (наличие или отсутствие эффекта) в коррекции портальной гипертензии у пациентов с циррозом печени, ассоциированного с гаплотипами гена ADRB2

Обсуждение

Пропранолол является неселективным блокатором β-адренорецепторов и длительное время применяется для первичной и вторичной профилактики кровотечений из ВРВП. Его терапевтический эффект обусловлен способностью снижать градиент печеночного венозного давления (ГПВД): блокада β1-адренорецепторов приводит к урежению частоты сердечных сокращений и снижению сердечного выброса, тогда как блокада β2-адренорецепторов вызывает вазоконстрикцию в спланхническом бассейне и уменьшение портального кровотока [12—14]. Вместе с тем у ряда пациентов с ЦП пропранолол не обеспечивает достаточного снижения ГПВД, что ограничивает его эффективность в профилактике кровотечений из ВРВП [15]. Причины межиндивидуальной вариабельности ответа на терапию остаются недостаточно изученными, что обусловливает актуальность поиска прогностических маркеров [16—19].

Наиболее изученными полиморфизмами гена ADRB2 являются +46G/A и +79C/G, которые состоят из замены аминокислот с Arg16 на Gly16 и Gln27 на Glu27. Эти изменения играют важную роль в деятельности сердца и изменяют степень подавления (down- регуляция) экспрессии рецептора на фоне стимуляции агонистом [17—20]. Нарушение сосудистой реактивности, опосредованной β2-адренорецептором (β2-AP), вовлечено в патогенез многих сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Клинико-генетические исследования, посвященные изучению ассоциации полиморфизма ADRB2 с развитием или исходом таких ССЗ, достаточно многочисленны, однако их результаты неоднозначны. Тем не менее проблема ассоциации полиморфизмов гена ADRB2 с реакцией организма на введение β-АБ сохраняет свою актуальность до настоящего времени [19—22].

Ряд исследований показал, что у нормотензивных пациентов носительство аллеля Gln27 ассоциировано с более низким исходным кровотоком и сниженной вазодилатацией в ответ на локальное введение β2-агониста (изопротеренола) по сравнению с носителями генотипа Glu27 [4, 5, 23]. Сходные результаты получены при применении β2-агонистов у пациентов с бронхиальной астмой [24, 25]. Однако данные о роли полиморфизмов β2-AP в коррекции ПГ остаются ограниченными.

В одном из таких исследований продемонстрированы индивидуальные различия в эффективности внутривенного введения пропранолола для профилактики кровотечения из ВРВП, которые связаны с полиморфизмами гена ADRB2. Пропранолол оказался более эффективным у пациентов с гомозиготным генотипом Gly16Gly или Glu27Glu, чем у носителей аллелей Arg16 или Gln27 [26].

Изучена ассоциация полиморфизмов гена ADRB2 с эффективностью перорального использования пропранолола для профилактики кровотечения из ВРВП. Носители гомозигот Gly16-Glu/Gln27 лучше отвечали на введение пропранолола, чем носители гомозигот Arg16-Gln27 или комплексных гетерозигот [3].

В настоящем исследовании оценивалась распространенность полиморфизмов гена ADRB2 в группе пациентов с ЦП. Наиболее распространенными оказались гетерозиготные варианты гаплотипов гена ADRB2, которые обнаруживались в 51,06% случаев. Несколько реже выявлялись гомозиготные варианты Gly16-Glu/Gln27 — у 36,17% пациентов. Самым редким стал гомозиготный гаплотип Arg16-Gln27, который обнаружен в 12,77% случаев. Эти данные согласуются с результатами китайского исследования, в котором распространенность гомозигот Gly16-Glu/Gln27 и Arg16-Gln27 и комплексных гетерозигот составила 29,7%, 10,9% и 59,4% соответственно [3]. Схожие результаты получены в испанском исследовании, в котором гетерозиготы встречались в 54,2% случаев, гомозиготы Gly16-Glu/Gln27 — в 29,1%, а гомозиготы Arg16-Gln27 — в 16,7% [26]. Эти данные аналогичны данным других западных исследований и исследований, проведенных в США [26—28].

До введения пропранолола носители различных гаплотипов β2-AP существенно не различались между собой по уровням ЧСС, что согласуется с результатами других исследователей [3]. Важным результатом данного исследования было то, что пациенты с ЦП и ПГ показали разные ответы на пропранолол (рассчитано по снижению ЧСС). Выбор критерия был основан на том, что, как известно, снижение ЧСС на 25% в покое или до 55 ударов в минуту при исходно низкой частоте пульса приводит к снижению ГПВД менее 10 мм рт.ст., снижая риск кровотечения [11]. Оказалось, что носители гомозиготы Gly16-Glu/Gln27 проявляли наилучший ответ на прием пропранолола (52,94%) по сравнению с носителями комплексных гетерозигот (20,83%) и гомозитного варианта Arg16-Gln27 (0,00%). При этом вероятность оказаться «ответчиком» более чем в 3 раза возрастала у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27 (p=0,01) и, наоборот, вероятность явиться «неответчиком» в 1,5 раза увеличивалась у носителей гомозигот Arg16-Gln27. Полученные результаты совпадают с данными другого исследования, согласно которому носители гомозигот Gly16-Glu/Gln27 лучше отвечали на введение пропранолола, чем носители гомозигот Arg16-Gln27 или комплексных гетерозигот (22,4±2,1%, 13,1±2,7% и 12,5±3,1% соответственно, p<0,01) [3].

Носительство гомозитного варианта Arg16-Gln27 приводило к незначительным изменениям основных гемодинамических показателей (ЧСС и АДср), что согласуется с результатами других исследований. Так, в работе D.R. Kong и соавт. пероральное лечение пропранололом приводило к более выраженному снижению ЧСС у носителей гомозигот Gly16-Glu/Gln27 по сравнению с носителями гомозигот Arg16-Gln27 (–20,2±1,4% и –14,8±2,2% соответственно, p =0,03). Носители комплексных гетерозигот в этом исследовании проявляли по сравнению с носителями гомозигот промежуточный ответ (–16,9±2,9%) [3]. Похожие результаты получены испанскими исследователями, которые обнаружили, что у пациентов с ЦП наличие гаплотипа Gly16-Glu/Gln27 способствует более выраженному снижению ЧСС в ответ на пропранолол по сравнению с носителями гомозигот Arg16-Gln27 и комплексных гетерозигот [26].

Таким образом, индивидуальная дифференциация эффекта пропранолола у пациентов с ЦП связана с полиморфизмами гена ADRB2. Замена аминокислоты в рецепторе с Arg16 на Gly16 приводит к усилению ответа на пероральный прием пропранолола.

Основными ограничениями данного исследования являются одноцентровой характер с участием относительно небольшого количества пациентов и отсутствие анализа конфаундеров.

Мы рекомендуем использовать определение полиморфных маркеров rs1042713 и rs1042714 гена ADRB2 в прогнозировании ответа на неселективные β-адреноблокаторы и принятия клинических решений в лечении портальной гипертензии у пациентов с ЦП. Для подтверждения полученных результатов необходимо провести дополнительные исследования с участием большего количества пациентов и учетом дополнительных конфаундеров.

Заключение

У пациентов с циррозом печени наиболее часто выявлялись гетерозиготные варианты гаплотипов гена ADRB2 (51,06%). Гомозиготные варианты Gly16-Glu/Gln27 встречались реже — у 36,17% пациентов. Наименее распространенным оказался гаплотип Arg16-Gln27, выявленный в 12,77% случаев.

Наиболее выраженный ответ на терапию пропранололом отмечен у пациентов с гомозиготным вариантом гаплотипа Gly16-Glu/Gln27 (52,94%) по сравнению с носителями комплексных гетерозигот (20,83%) и гомозигот Arg16-Gln27 (0,00%).

Вероятность достижения терапевтического ответа на пропранолол была более чем в 3 раза выше у носителей гомозиготного гаплотипа Gly16–Glu/Gln27 (p=0,01). Напротив, у носителей гомозигот Arg16-Gln27 вероятность отсутствия ответа увеличивалась в 1,5 раза (p=0,0002).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, общее редактирование и утверждение окончательного варианта статьи — Михайлова Е.И.,

Обзор публикаций по теме статьи, сбор материала, анализ и статистическая обработка результатов и их изложение, обсуждение и выводы, библиография — Молчанова А.В.,

Лабораторное исследование набранного материала — Осипкина О.В.

Authors’ contribution:

Study conception and design, general editing, and approval of the final version of the manuscript — Mikhailova E.I.

Review of publications relevant to the article, data collection, analysis and statistical processing of the results, presentation of the findings, discussion and conclusions, and bibliography — Molchanova A.V.

Laboratory analysis of the collected material — Osipkina O.V.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.