Задержка роста плода (ЗРП) является тяжелым осложнением беременности, приводящим к высокой перинатальной заболеваемости и смертности. Эта акушерская патология формируется как следствие патологических процессов, происходящих в системе мать—плацента—плод, и, прежде всего, в плаценте. Частота ЗРП составляет от 5 до 30% всех родов и не имеет тенденции к снижению [1, 2]. На долю ЗРП в структуре перинатальной смертности приходится до 15% [3]. Несмотря на большое число работ, посвященных ЗРП, механизмы ее развития недостаточно изучены, что снижает эффективность проводимого лечения. Особенно это касается молекулярных аспектов формирования такого осложнения беременности.
Важное значение в обеспечении нормального течения перинатального периода онтогенеза имеет состояние ключевых реакций регуляции, прежде всего, белкового обмена. К их числу относятся: посттрансляционное фосфорилирование/дефосфорилирование белков, осуществляющееся циклическими нуклеотидами [4, 5], карбонилирование [6], аминирование и амидирование [7, 8]. Субстратами этих реакций могут являться многочисленные белки, в том числе ферменты и их субстраты, специфические белки беременности плацентарного происхождения, белки, обладающие пластическими, транспортными, коммуникационными, гормональными свойствами. Изменения последних играют особенно негативную роль, поскольку в плаценте, лишенной иннервации, влияние гормонального контроля над течением метаболических процессов достаточно велико. Регуляторные возможности белков во многом зависят от их субклеточной локализации. Весьма важными для нормальной работы фетоплацентарной системы являются белки митохондрий и цитоплазмы, выполняющих в клетке многочисленные функции. Известно, что плацента характеризуется большим количеством митохондрий [9], генерация энергии в которых используется как для собственных нужд плаценты, так и для обеспечения потребностей развивающегося плода. Кроме того, очень важно, что плацентарные митохондрии интенсивно расщепляют боковую цепь холестерина в ходе синтеза стероидных гормонов [10]. Для функций цитоплазмы большое значение имеют входящие в ее состав специфические белки беременности плацентарного происхождения, обладающие иммуносупрессивной активностью, позволяющей выживать антигенно чужеродному плоду в организме матери [11]. Поскольку повреждение функций плаценты в значительной степени лежит в основе нарушения роста плода [12, 13], модификация структуры и физико-химических свойств белков в этом органе, несомненно, будет играть ведущую роль в развитии ЗРП.
Исходя из изложенного и малочисленности данных о состоянии белков субклеточных фракций плаценты [14, 15], мы провели данное исследование.
Цель исследования — изучить посттрансляционные модификации митохондриальных и цитоплазматических белков плаценты при ЗРП и оценить их роль в формировании этого осложнения беременности.
Материал и методы
Дизайн исследования
Нами проведено обсервационное одноцентровое одномоментное контролируемое исследование. Из 400 беременных, наблюдавшихся в НИИ акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России, в исследование включены 57 женщин, отобранных случайным образом в результате простой рандомизации с использованием таблицы «случайных чисел». Обследованы клинически здоровые женщины с неосложненным течением беременности и родов и женщины с симметричной формой ЗРП.
Критерии соответствия
Критерии включения в контрольную группу: физиологическое течение беременности; доношенная беременность; возраст от 20 до 35 лет.
Критерии включения пациенток в основную группу (и для установления диагноза): нарушения кровотока в маточно-плацентарном или плодово-плацентарном звене без признаков централизации кровообращения по данным допплерометрии, соответствующие изменению гемодинамики I степени по классификации А.Н. Стрижакова; проявления гипоксии плода при кардиотокографии; отставание роста плода по данным ультразвуковой фетометрии.
Критерии исключения: инфекционные заболевания; декомпенсированные формы соматических заболеваний; многоплодная беременность и недоношенная беременность; признаки преэклампсии; аутоиммунная патология; отсутствие информированного согласия на расширенный протокол исследования.
Условия проведения
Исследование выполнено на базе клинических и научных подразделений НИИ акушерства и педиатрии РостГМУ Минздрава России.
Продолжительность исследования
Исследование проведено в период с 2017 по 2019 г.
Описание медицинского вмешательства
Все необходимые и регламентируемые приказом Минздрава России №572н от 01.11.2012 исследования включали клинические, клинико-лабораторные и функциональные методы исследования.
Основной исход исследования
Конечной точкой исследования явилось определение молекулярно-клеточных показателей, позволяющих судить об изменении структуры белков субклеточных фракций плаценты при ЗРП по сравнению с таковыми при физиологической гестации.
Дополнительные исходы исследования
Дополнительные исходы исследования отсутствуют, поскольку все изученные показатели и значения их изменений при ЗРП отражены в основном исходе исследования.
Анализ в подгруппах
Сравниваемые группы женщин статистически значимо не различались по акушерскому и соматическому анамнезу, поэтому деление на подгруппы не проводилось.
Методы регистрации исходов
Материалом для исследования служила ткань плаценты. Образцы плаценты получали сразу после родов при соблюдении холодового режима (T=+2...+4 °C). Для проведения исследования брали центральную часть макроскопически нормальных участков плаценты, включая плодовую и материнскую поверхности, не затрагивая крупных сосудов. Образцы (10 г) после промывания охлажденным физиологическим раствором гомогенизировали (при T=+4 °C) в 0,25 М растворе сахарозы, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4) в присутствии ингибиторов протеаз с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax (IKA, Германия). Для удаления ядер и неразрушенных клеток гомогенаты центрифугировали при 1000×g 15 мин. Из супернатанта выделяли митохондриальную фракцию центрифугированием при 12 000×g 20 мин при +4 °C. Цитоплазматическую фракцию получали после центрифугирования при 105 000×g 60 мин при +4 °C.
Посттрансляционное фосфорилирование митохондриальных и цитоплазматических белков оценивали по активности циклонуклеотидзависимых протеинкиназ (цАМФ-ПК и цГМФ-ПК), о которой судили по включению радиоактивного фосфора в белки из [γ–32P] АТФ. Инкубационная смесь содержала 10 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7,4), 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 0,2 мкКи–32 P-АТФ, а также 10 мкМ цАМФ для определения активности цАМФ-ПК и 10 мкМ цГМФ для определения активности цГМФ-ПК. По окончании реакции содержимое пробирок наносили на фильтр Millipore (Merck, Германия) с диаметром пор 0,45 мкм, высушивали и считали в сцинтилляционном счетчике γ-частиц ЭЛБ-190.014.02 (ООО «ЭнергияЛаб», Россия).
О степени окислительной модификации белков судили по количеству карбонильных производных (окисленных аминокислотных остатков белков), оцененных по реакции их взаимодействия с 2,4-дифенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [16]. Определяли спонтанное и металлкатализируемое окисление белков. В последнем случае для инициации процессов окисления белков реакцию проводили в присутствии системы доноров электронов (перекись водорода) и металлов переменной валентности (Fe2+). Степень аминирования белков определяли по разности между концентрацией общего аминоазота в экстракте белков и остаточного аминоазота в нейтрализованных экстрактах после осаждения белков раствором 20% трихлоруксусной кислоты [17]. Количество амидных групп оценивали по уровню аммиака, отщепившегося после 10-минутного и 2-часового гидролиза белков в 0,5 М H2SO4 (соответственно для легкогидролизуемых и трудногидролизуемых групп), с помощью классической реакции несслеризации [18].
Этическая экспертиза
Информированное согласие на использование биоматериала для научных исследований получено от всех пациенток. Исследования проводились в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинкской декларации (2000 г.) и протоколе Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1999 г.), и одобрено этическим комитетом НИИАП РостГМУ Минздрава России (протокол №72/1 от 23.05.17).
Статистический анализ
Принцип расчета размера выборки. Размер выборки предварительно не рассчитывался.
Методы статистического анализа данных. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы StatSoft Inc., США). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствовала об их нормальном распределении. Данные представлены в виде среднего значения (M), стандартного отклонения (SD) и 95% доверительного интервала (95% ДИ). Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок, а также по c2-критерию для сравнения категориальных переменных. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Результаты
Объекты (участники) исследования
Обследованы 57 женщин в возрасте 24—30 лет, составившие 2 группы. В контрольную группу включено 27 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов. Основную группу составили 30 женщин, беременность которых осложнилась симметричной формой ЗРП на фоне плацентарной недостаточности, верифицированной после родов. Сравниваемые группы пациенток статистически значимо не различались по акушерскому и соматическому анамнезу (табл. 1). У пациенток обеих групп питание было полноценным и сбалансированным по основным ингредиентам, в том числе по белковому компоненту.
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток
| Показатель | Контрольная группа, n=27 | Основная группа, n=30 | p |
| Возраст, лет* | 25,8±10,12 | 27,4±14,28 | 0,0548 |
| Исходный ИМТ, кг/м2* | 26,9±6,98 | 28,8±7,16 | 0,316 |
| Первородящие, n (%)** | 14 (51,9) | 16 (53,3) | 0,878 |
| Повторнородящие, n (%)** | 13 (48,1) | 14 (46,7) | 0,878 |
| Аборты, n (%)** | 6 (22,2) | 7 (23,3) | 0,829 |
| Срок родоразрешения, недели* | 39,7±3,18 | 38,1±6,22 | 0,235 |
| Наличие хронических заболевания, n (%)** | 10 (37,1) | 11 (36,7) | 0,806 |
Примечание. Данные представлены в виде: * — M±SD, t-тест; ** — в виде абсолютных чисел (%), c2-тест; ИМТ — индекс массы тела.
Согласно оценочной шкале, используемой в неонатальной практике [19], новорожденным основной группы установлен диагноз ЗРП I степени с учетом гестационного возраста при рождении. Масса тела и длина новорожденных этой группы составили 2606,41±208,32 г и 45,15±1,53 см, массово-ростовой коэффициент 57,73±2,31. У детей контрольной группы эти показатели были равны 3414,32±273,25 г (p=0,021) и 52,24±3,05 см (p=0,037) соответственно, массово-ростовой коэффициент — 65,36±3,05 (p=0,048). Гистологическое исследование плаценты, проведенное на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксином и эозином, выявило патологические изменения, являющиеся морфологическими критериями плацентарной недостаточности — фиброз стромы ворсин, выпадение фибрина, вариант хаотичных склерозированных ворсин и эмбриональных ворсин, участки кальциноза, гиперваскуляризация ворсин, кровоизлияние в строму ворсин. Средняя масса плацент в контрольной группе составила 564±40 г, в основной 456±31 г (p=0,035).
Основные результаты исследования
Полученные данные свидетельствуют о различных посттрансляционных изменениях структуры белков митохондрий и цитоплазмы плаценты при беременности, осложненной ЗРП (табл. 2).
Таблица 2. Интенсивность посттрансляционных модификаций белков митохондрий и цитоплазмы в контрольной и основной группах (при физиологической беременности и задержке роста плода)
| Показатель | Контрольная группа, n=27 | Основная группа, n=30 | p1 | p2 | ||
| белки митохондрий | белки цитоплазмы | белки митохондрий | белки цитоплазмы | |||
| Активность цАМФ-зависимых протеинкиназ, имп/с/мг белка | 58,61±29,88 [47,34—69,88] | 51,72±18,76 [44,64—58,80] | 35,64±19,61 [28,62—42,66] | 38,22±16,27 [32,40—44,04] | 0,001 | 0,005 |
| Активность цГМФ-зависимых протеинкиназ, имп/с/мг белка | 40,63±16,21 [34,51—46,75] | 39,54±15,85 [33,56—45,52] | 50,81±2,14 [50,05—51,57] | 30,31±12,21 [25,94—34,86] | 0,001 | 0,016 |
| Карбонильные производные (спонтанное окисление), мкмоль/г белка | 3,69±1,25 [3,22—4,16] | 2,72±0,99 [2,35—3,09] | 5,19±2,14 [4,43—5,95] | 3,66±1,42 [3,15—4,17] | 0,002 | 0,006 |
| Карбонильные производные (металлкатализируемое окисление), мкмоль/г белка | 4,85±1,66 [4,22—5,48] | 3,47±1,20 [3,02—3,92] | 7,25±3,34 [6,05—8,45] | 5,14±2,36 [4,30—5,98] | 0,001 | 0,002 |
| Амидные группы трудногидролизуемые, мкмоль/г белка | 57,31±21,41 [49,23—65,39] | 64,36±24,71 [55,13—73,59] | 25,92±11,34 [21,86—29,98] | 24,71±10,19 [21,06—28,36] | 0,001 | 0,001 |
| Амидные группы легкогидролизуемые, мкмоль/г белка | 16,51±6,75 [13,96—19,06] | 14,36±5,04 [12,46—16,26] | 11,34±4,33 [9,79—12,89] | 10,59±3,12 [9,26—11,92] | 0,001 | 0,002 |
| Аминные группы, мкмоль/г белка | 19,10±9,61 [15,47—22,73] | 16,59±8,00 [13,57—19,61] | 11,31±7,67 [8,57—14,05] | 10,53±5,15 [8,69—12,37] | 0,001 | 0,001 |
Примечание. Данные представлены в виде M±SD и [95% ДИ], t-тест. Статистическая значимость между показателями в контрольной и основной группах: p1 — для белков митохондрий; p2 — для белков цитоплазмы.
Для фосфорилирования белков установлено, что степень изменения его интенсивности зависит от циклического нуклеотида, регулирующего протеинкиназную активность, а также от субклеточной локализации белков. Так, активность цАМФ-ПК снижена при ЗРП по отношению к митохондриальным белкам на 39,2% (p=0,001), а для цитоплазматических белков уменьшение составляет 26,1% (p=0,005) по сравнению с аналогичными показателями при физиологической беременности. Активность цГМФ-ПК при использовании в качестве субстратов белков цитоплазмы также снижена на 23,4% (p=0,016). В то же время цГМФ-зависимое фосфорилирование белков митохондрий превышает контрольную величину на 25% (p=0,001). Следует отметить, что при физиологической беременности также наблюдаются различия в соотношении активности двух протеинкиназ в субклеточных фракциях плаценты, однако они имеют противоположную направленность: активность цАМФ-ПК в митохондриях на 30,7% (p=0,008) выше, чем цГМФ-ПК, а в цитоплазме, напротив, на 24,3% (p=0,013) ниже.
Наряду с изменением процессов фосфорилирования белков при ЗРП усиливается окислительная модификация белков изученных субклеточных фракций плаценты, выражающаяся в повышении степени их карбонилирования. Для спонтанного окисления белков цитоплазмы повышение составило 34,5% (p=0,006). В присутствии перекиси водорода и Fe2+ карбонилирование этих белков при ЗРП выше, чем в контрольной группе на 48,1% (p=0,002). Оценка не только спонтанного, но и металлкатализируемого окисления белков повышает информативность изучения этих процессов, поскольку в нативной клетке именно металлкатализируемое окисление может протекать достаточно интенсивно. Содержание карбонильных производных в белках митохондрий при спонтанном окислении возрастает на 40,6% (p=0,002), а при металлкатализируемом — на 56,5% (p=0,001) по сравнению с таковыми при физиологической беременности.
Развитие ЗРП происходит также на фоне такой важной модификации белков плаценты, как амидирование. Содержание легкогидролизуемых амидных групп в митохондриальных белках снижается на 31,5% (p=0,001), а трудногидролизуемых — на 45,3% (p=0,001) по сравнению с аналогичными показателями при физиологической беременности. В цитоплазматических белках количество легкогидролизуемых амидных групп понижается на 26,6% (p=0,002), а трудногидролизуемых — на 56,9% (p=0,001). Различия в изменении степени гидролизуемости отражаются на величине коэффициента соотношения: в митохондриальных белках он снижается на 27,3% (p=0,015), а в цитоплазматических — на 36,4% (p=0,017).
Наряду с нарушением степени амидирования при ЗРП изменяется и количество аминных групп. В митохондриальных белках плаценты уровень аминных групп снижается на 39,7% (p=0,001), а в цитоплазматических — на 30,2% (p=0,001) относительно их величин при нормальной гестации.
Нежелательные явления
Нежелательные явления, возникшие в результате проведения исследования, не отмечены.
Обсуждение
Резюме основного результата исследования
Установленные нами посттрансляционные изменения, характеризующиеся снижением процессов фосфорилирования, амидирования, аминирования, увеличением окислительного карбонилирования и охватывающие различные уровни структуры белков разных субклеточных фракций плаценты, несомненно, играют негативную роль в функционировании как плаценты, так и всего фетоплацентарного комплекса. Полученные данные позволяют уточнить патогенетические аспекты развития ЗРП, что необходимо для оптимизации проводимого лечения этой акушерской патологии.
Обсуждение основного результата исследования
Развитие осложненной беременности во многом связано с нарушением механизмов клеточной регуляции, прежде всего, белкового обмена, поскольку белки играют ключевую роль в контроле течения молекулярных процессов в клетке, включая пластические (трофические) процессы [4]. Это относится и к ЗРП, так как именно нарушение трофики плода, как и энергетическое ее обеспечение, являются важной причиной формирования этой патологии [12]. Однако, несмотря на несомненную важность, информация о клеточно-молекулярной регуляции белкового обмена в субклеточных структурах плаценты при ЗРП практически отсутствует.
Одной из реакций, контролирующих главные клеточные процессы, является обратимое фосфорилирование белков, катализируемое циклическими нуклеотидами [4]. Значительное снижение при ЗРП цАМФ-зависимого фосфорилирования белков митохондрий, несомненно, приводит к немаловажным нарушениям. Среди них ключевое место занимают ферменты цикла Кребса и других путей генерации энергии, ингибирование активности которых сопровождается уменьшением энергетического потенциала клетки. Что касается цитоплазматических белков, то даже незначительное изменение степени их фосфорилирования также будет способствовать развитию глубоких нарушений в плаценте, поскольку эти белки составляют более 30% ее белкового фонда [20] и участвуют в осуществлении трофических, осмотических, транспортных процессов, обеспечении иммунологической совместимости матери и плода [11]. Что касается повышения интенсивности цГМФ-зависимого фосфорилирования митохондриальных белков плаценты, можно полагать, что оно имеет компенсаторный характер и направлено на поддержание процессов клеточного дыхания в условиях внутриутробной гипоксии, наблюдающейся при ЗРП [21].
Важным механизмом в общей цепи метаболических поломок в плаценте при ЗРП, формирующейся на фоне внутриутробной гипоксии, является свободнорадикальное повреждение клеточных компонентов в результате гиперпродукции активных форм кислорода. При анализе полученных данных обращает внимание то, что при ЗРП интенсивность обоих видов карбонилирования белков митохондрий возрастает в большей степени, чем цитоплазматических белков. По-видимому, это может быть связано с повышенной чувствительностью таких белков плаценты к действию свободных радикалов в условиях гипоксии [22]. Усиление окислительной деструкции белков митохондрий и цитоплазмы, особенно металлкатализируемого окисления, при ЗРП, скорее всего, будет нарушать структуру белков, причем не только боковых цепей аминокислотных остатков, но и более глубоких участков белковой молекулы [23, 24]. Избыточное образование карбонильных производных сопровождается фрагментацией полипептидов, а также повышением их гидрофобности [6], что приводит к дестабилизации белковой молекулы. Последнее повышает чувствительность белков к действию пептидгидролаз и, как следствие, изменяет их регуляторные функции. Наиболее негативным является тот факт, что окисленные белки будут продолжать участвовать в передаче информации в искаженном виде.
Повреждение различных уровней структуры белковых молекул подтверждает и снижение содержания амидных групп белков, поскольку они во многом определяют степень спирализации, растворимость, заряд белка. Различная степень снижения легко- и трудногидролизуемых амидных групп может быть следствием качественных нарушений в составе белков.
Аналогичная направленность изменений характерна и для аминных групп, принимающих участие в стабилизации нативной структуры белковых молекул. В определенной степени снижение уровня аминных групп происходит за счет окисления аминокислотных остатков белковой цепи в результате повышения реакций карбонилирования, что свидетельствует о взаимозависимости этих двух модификаций. Уменьшение количества аминогрупп, как и повышение карбонильных производных, по-видимому, сопровождается снижением устойчивости белков к гидролитической деструкции. В свою очередь, протеолитическая деструкция митохондриальных и цитоплазматических белков вряд ли будет оставаться без существенных последствий для их структуры и биологической активности. Одним из следствий посттрансляционных модификаций белков, выявленных в ходе исследования, очевидно, является изменение протеомного спектра плаценты, имеющееся при ЗРП [25].
Подытоживая результаты проведенных исследований с учетом основных функций митохондриальных и цитоплазматических белков плаценты, следует еще раз отметить особенно негативную роль нарушения реакций энергетического обмена, а также пластических, транспортных процессов, приводящих к формированию дисфункции плаценты и развитию ЗРП.
Ограничения исследования
К ограничениям исследования необходимо отнести тот факт, что все пациентки наблюдались в НИИ акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России и были представительницами Южного федерального округа. Результаты данного исследования могут быть значимы на региональном уровне.
Заключение
Гестационный процесс в целом, как и состояние фетоплацентарного комплекса, во многом определяются интенсивностью клеточной регуляции, зависящей от структуры и свойств белков, прежде всего, плаценты, осуществляющей взаимосвязь между организмами матери и плода. Характер процессов клеточной регуляции зависит от субклеточной локализации белков, весьма важными среди которых являются белки митохондрий и цитоплазмы. К числу основных реакций посттрансляционной модификации белков относятся фосфорилирование, карбонилирование, амидирование, аминирование. Циклонуклеотидзависимое фосфорилирование, осуществляющееся с помощью специфических протеинкиназ, статистически значимо изменяется в обоих типах белков, причем активность цАМФ-ПК при задержке роста плода в цитоплазме снижается в большей степени, чем активность цГМФ-ПК. В митохондриях цАМФ-активируемое фосфорилирование также ниже контрольных показателей, в то время как для цГМФ-ПК, напротив, установлено повышение по сравнению с аналогичной величиной при физиологической беременности. Это свидетельствует об определенных различиях структуры белков в митохондриальной и цитоплазматической фракциях.
Посттрансляционные изменения характеризуются также окислительным повреждением белков, которое происходит под действием усиления процессов карбонилирования, изменяющих разные уровни структуры белков (в том числе вторичной и третичной). Кроме того, значительный вклад в модификацию мембранных и цитоплазматических белков плаценты при задержке роста плода вносит снижение содержания амидных и аминных групп, во многом определяющих особенности свойств белков, а также устойчивость пептидных связей к действию повреждающих факторов. Все эти нарушения структуры белковых молекул изменяют их регуляторные возможности и, следовательно, повреждают функциональную активность митохондрий и цитоплазмы.
Таким образом, нарушения, возникающие в структуре и свойствах белков плаценты, с учетом того факта, что они происходят на посттрансляционном уровне регуляции протеосинтеза, могут служить молекулярной основой метаболических и функциональных повреждений при развитии дисфункции плаценты и ее тяжелого осложнения — задержки роста плода.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Погорелова Т.Н.
Сбор и обработка материала — Михельсон А.А., Гунько В.О.
Статистический анализ данных — Гунько В.О.
Написание текста — Погорелова Т.Н.
Редактирование — Погорелова Т.Н., Гунько В.О.
Источник финансирования. Исследование выполнено за счет финансирования по государственному заданию №056-00144-18-00 от 26.12.2017 в рамках НИР «Постгеномные технологии в изучении процессов, нарушающих генеративную функцию женщин вне и во время беременности».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.