Лейомиома матки является одним из наиболее распространенных доброкачественных новообразований женской репродуктивной системы. Частота возникновения этой опухоли варьирует от 50% в репродуктивном возрасте до 70—80% среди женщин старше 50 лет [1—3]. Приблизительно у 15—25% женщин наблюдаются симптомы лейомиомы различной степени тяжести, включая дисфункцию тазовых органов, аномальные маточные кровотечения, анемию, болевой синдром, бесплодие [4, 5].
Этиопатогенез данного заболевания до сих пор недостаточно изучен, несмотря на большое количество исследований в этой области. Однако имеются данные, согласно которым нарушения нейроэндокринной и иммунной систем, повышенный индекс массы тела, семейный анамнез, этническая принадлежность и другие факторы значительно повышают риск развития миомы матки [6].
Тактика ведения пациенток с миомой матки индивидуальна и определяется течением заболевания, клинической картиной, а также репродуктивными целями женщины. В отсутствие симптомов и при наличии миоматозных узлов небольших размеров (до 12 нед беременности) пациенткам может быть рекомендовано динамическое наблюдение. При миоме матки больших размеров, субмукозной локализации миоматозного узла, а также при наличии аномальных маточных кровотечений с развитием анемии по причине данного заболевания, при дисфункции органов малого таза, при быстром росте опухоли (увеличение более чем на 4 нед беременности в течение 1 года), бесплодии в отсутствие других причин показано проведение хирургического лечения [4].
Доступ и объем оперативного лечения определяются в зависимости от возраста пациентки и репродуктивных задач. У женщин репродуктивного возраста с целью сохранения матки для дальнейшей реализации детородной функции рекомендовано проведение консервативной миомэктомии с применением лапароскопического доступа, что позволяет повысить вероятность наступления беременности и вынашивания плода на 25—30% [2, 7]. Рецидивирование миомы матки после ранее проведенного хирургического лечения, согласно данным литературы, происходит в 90% случаев, что обусловливает необходимость повторного хирургического лечения у 1,3—27% пациенток [5, 7].
Представляется актуальным создание современных диагностических панелей для прогнозирования не только рисков развития, но и рецидивирования миомы матки. Данный диагностический метод, основанный на исследовании генотипа женщин, позволит оптимизировать тактику ведения пациенток относительно объема хирургического лечения и доступа, а также, возможно, методов и сроков реализации репродуктивной функции, в том числе и в программах вспомогательных репродуктивных технологий [2, 4, 5].
Цель исследования — поиск генетических маркеров риска развития лейомиомы матки для повышения эффективности ранней диагностики и прогнозирования рецидивирования данного заболевания.
Информация о соблюдении этических норм. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическими комитетами всех участвующих клинических центров. До включения в исследование у всех участников получено письменное информированное согласие.
Материал и методы
Получение образцов
Отбор пациентов для проведения данного исследования осуществляли в отделении оперативной гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Для 20 пациенток с отягощенным семейным анамнезом по миоме матки и наличием соматических мутаций в гене MED12 (основная группа) и 14 пациенток группы контроля (женщины в постменопаузе, не имевшие в анамнезе миомы матки) проведен микроматричный анализ на чипах SNP 6.0 (Thermo Fisher, США). Получены данные о генотипах всех образцов по 906 600 однонуклеотидным полиморфизмам (rs), встречающимся в геноме человека. При помощи статистического анализа вычислены частоты по всем исследованным полиморфизмам и выявлены такие rs, частоты по которым статистически значимо отличались бы у женщин группы контроля и исследуемой группы.
Все случаи лейомиомы подтверждены гистологически, а наличие и тип мутаций в гене MED12 в каждом полученном миоматозном узле детектированы в лаборатории молекулярной генетики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова». От каждой пациентки получены образец крови, образцы тканей миоматозных узлов. Для каждой женщины создана индивидуальная карта пациента с информацией о клинико-анамнестических данных.
ДНК выделяли из образцов крови и тканей миоматозных узлов с помощью набора QIAAMP DNA Mini (Qiagen, США) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы ДНК, прошедшие контроль качества (260/280 коэффициент поглощения 1,80—2,0, а также производился визуальный контроль целостности нативной ДНК с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле).
Определение соматических мутаций в гене MED12 в тканях миом
Наличие соматических мутаций в гене MED12 пациенток с миомой матки и отягощенным анамнезом (20 женщин) — GWAS-когорты — определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру экзона 2 гена MED12. Все выявленные мутации идентифицированы как соматические с помощью секвенирования ампликонов, полученных из ДНК, выделенной из периферической крови. Соматические мутации экзона 2 гена MED12 обнаружены в 1—3 узлах у всех пациенток, включенных в GWAS-когорту.
Анализ данных с микрочипов
Сканирование связи SNP с целым геномом проводили с использованием массивов SNP 6.0 для всего генома человека, состоящих примерно из 906 600 однонуклеотидных полиморфизмов. После окрашивания и промывки с помощью Gene Chip Fluidics Station 450 массивы сканировали, используя 3000 7G-сканер. Полученные данные проанализированы с помощью программного обеспечения Genotyping Console (GTC) (версия 4.1.4.840). Все микрочипы соответствовали параметрам контроля качества (QC).
Списки SNP-генотипирования по 906 600 однонуклеотидным полиморфизмам для каждого образца ДНК получены с помощью программного обеспечения ChaS (Thermo Fisher, США). Частота минорных аллелей (MAF) рассчитана для пациенток с миомой матки (20 образцов) и для женщин группы контроля (14 образцов).
Генотипирование
Локусы SNP, статистически значимо ассоциированные с наличием миомы матки или ее отсутствием у здоровых женщин из группы контроля, выбраны с использованием точного критерия Фишера (p<0,0005). Для последующего анализа выбраны кандидатные SNP, у которых частота минорного аллеля оказалась выше 0,05 или ниже 0,2.
Для дальнейшего анализа отобраны 6 SNP (rs3020434, rs11742635, rs124577644, rs12637801, rs2861221, rs17677069), локализованных в интронах генов ESR1, FBN2, CELF 4, KCWMB2.
ПЦР-генотипирование
Отобранные SNP проанализированы путем индивидуального генотипирования большего набора образцов. После выбора «перспективного» SNP (табл. 1) для каждого полиморфизма создан набор специфических праймеров и все образцы, полученные у 215 пациенток с миомой матки и 30 женщин группы контроля, амплифицированы и секвенированы с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США).
Таблица 1. Частоты вариантов полиморфизмов rs3020434, rs11742635, rs124577644, rs12637801, rs2861221, rs17677069 у пациенток с миомой матки и отягощенным анамнезом по данному заболеванию и у женщин группы контроля
| ID | Суммарное число аллелей 28 | Группа контроля, n=14 | Суммарное число аллелей 40 | Группа пациенток с миомой матки и отягощенным анамнезом, n=20 | ||||||
| A (%) | B (%) | AA (%) | AB (%) | BB (%) | A (%) | B (%) | AA (%) | AB (%) | BB (%) | |
| rs12637801 | 42,86 | 57,14 | 35,71 | 14,29 | 50,00 | 90,00 | 10,00 | 85,00 | 10,00 | 5,00 |
| rs17677069 | 67,86 | 32,14 | 50,00 | 35,71 | 14,29 | 100,00 | 0,00 | 100,00 | 0,00 | 0,00 |
| rs11742635 | 67,86 | 32,14 | 50,00 | 35,71 | 14,29 | 100,00 | 0,00 | 100,00 | 0,00 | 0,00 |
| rs2861221 | 64,29 | 35,71 | 42,86 | 42,86 | 14,29 | 97,50 | 2,50 | 95,00 | 5,00 | 0,00 |
| rs12457644 | 64,29 | 35,71 | 42,86 | 42,86 | 14,29 | 97,50 | 2,50 | 95,00 | 5,00 | 0,00 |
| rs3020434 | 64,29 | 35,71 | 35,71 | 57,14 | 7,14 | 97,50 | 2,50 | 95,00 | 5,00 | 0,00 |
Статистический анализ
Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Для каждого SNP вычислены частоты аллелей и генотипов у женщин с миомой матки и здоровых женщин группы контроля. Влияние различий в частоте генотипов на риск развития миомы матки у пациенток основной группы и группы контроля проверено с помощью стандартного χ2-теста Пирсона и отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ).
Результаты
Основные клинические характеристики
В наше исследование включены 245 пациенток, из них 30 женщин контрольной группы и 215 пациенток основной группы (с миомой), из них 98 имели отягощенный семейный анамнез по миоме матки, 94 — без отягощенного семейного анамнеза и 23 не имели информации о своем анамнезе. Средний возраст больных с лейомиомой составил 43±24 года, среди женщин с отягощенным семейным анамнезом — 42,5±24,5 года, без отягощенного семейного анамнеза — 42±23 года, у пациенток без сведений об анамнезе — 38±9 лет и группы контроля — 51±16 лет. У 128 (59%) пациенток с миомой матки отмечены такие симптомы, как аномальные маточные кровотечения и нарушение менструального цикла. У 41 (19%) из них отмечались симптомы тазовой боли и дисменорея, у 92 (43%) — анемия различной степени тяжести, у 27 (13%) больных миомой матки отмечена дисфункция органов малого таза и у 15 (7%) — бесплодие.
Средний размер узлов составил 12,65±12,35 см (у женщин с отягощенным семейным анамнезом диапазон составил 0,3—21 см, у женщин без отягощенного семейного анамнеза — 0,5—25 см, у пациенток, не имеющих сведений о семейном анамнезе, — 0,5—10,4 см).
Использование GWAS-анализа позволило выделить 6 полиморфизмов rs3020434, rs11742635, rs124577644, rs12637801, rs2861221, rs17677069, расположенных в генах ESR1, FBN2, CELF4, KCWMB2, вероятно, связанных с высоким риском развития миомы матки. Группа контроля состояла из женщин в постменопаузе без лейомиомы и отягощенного семейного анамнеза по данной патологии. В группу пациенток с миомой матки включены женщины с выявленной миомой, имеющие сведения об отягощенности анамнеза по данному заболеванию, в большинстве узлов которых обнаружены мутации в гене MED12. Результаты проведенного исследования представлены в табл. 1.
Большие когорты для ПЦР-анализа
Проверенные GWAS-производные SNP дополнительно проанализированы с помощью индивидуального генотипирования большого набора образцов. Когорта пациенток с миомой матки включала 215 человек, группа контроля — 30 женщин.
Полученные аллельные частоты приведены в табл. 2 наряду с литературными данными об этих полиморфизмах в разных популяциях. Частоты минорных аллелей всех шести SNP равны между представителями европеоидного населения и общей выборкой нашего исследования (см. табл. 2).
Таблица 2. Частоты аллелей SNP в общей популяции и у исследуемых женщин
| ID | Восточная Азия | Европа | Америка | Южная Азия | Африка | Всего | Настоящее исследование | ||
| группа контроля | все пациентки с миомой матки | пациентки с миомой матки и отягощенным анамнезом | |||||||
| rs12637801 | 0,20 | 0,16 | 0,23 | 0,18 | 0,02 | 0,12 | 0,23 | 0,09 | 0,08 |
| rs17677069 | 0,11 | 0,19 | 0,11 | 0,16 | 0,10 | 0,17 | 0,29 | 0,14 | 0,13 |
| rs11742635 | 0,11 | 0,19 | 0,11 | 0,16 | 0,10 | 0,17 | 0,25 | 0,15 | 0,13 |
| rs2861221 | 0,34 | 0,17 | 0,23 | 0,10 | 0,12 | 0,16 | 0,21 | 0,16 | 0,06 |
| rs12457644 | 0,34 | 0,18 | 0,23 | 0,10 | 0,06 | 0,24 | 0,31 | 0,22 | 0,15 |
| rs3020434 | 0,10 | 0,18 | 0,09 | 0,19 | 0,12 | 0,21 | 0,33 | 0,18 | 0,06 |
Все данные о частотах генотипов у пациенток с миомой матки без отягощенного анамнеза и пациенток с семейной предрасположенностью к данной патологии, а также женщин группы контроля представлены в табл. 3.
Таблица 3. Частоты генотипов у обследованных пациенток
| Ген | SNP ID | Генотип/ аллель | Всего | Пациентки с миомой матки и без отягощенного семейного анамнеза | Пациентки с миомой матки и отягощенным семейным анамнезом | Группа контроля | p-value Группа контроля/все с миомой матки Группа контроля/пациентки с отягощенным анамнезом | ОШ (95٪ ДИ) Все пациентки с миомой матки/пациентки с отягощенным анамнезом |
| CELF4 | rs2861221 | CC/CG/GG | 0,70/0,25/0,05 | 0,65/0,32/0,03 | 0,79/0,19/0,02 | 0,60/0,30/0,10 | 0,087/0,017 | 1,33/2,33 |
| rs12457644 | GG/AG/AA | 0,69/0,22/0,09 | 0,64/0,27/0,08 | 0,79/0,17/0,04 | 0,53/0,33/0,13 | 0,045/0,013 | 2,21/3,64 | |
| FBN2 | rs11742635 | GG/GT/TT | 0,73/0,24/0,03 | 0,74/0,24/0,02 | 0,77/0,22/0,01 | 0,57/0,37/0,07 | 0,137/0,025 | 1,99/3,33 |
| rs17677069 | AA/AG/GG | 0,69/0,25/0,05 | 0,60/0,40/0 | 0,79/0,17/0,04 | 0,53/0,30/0,17 | 0,007/0,001 | 2,6/3,95 | |
| KCNMB2 | rs12637801 | CC/CA/AA | 0,75/0,23/0,02 | 0,76/0,22/0,02 | 0,79/0,18/0,03 | 0,53/0,47/0 | 0,006/0,010 | 4,4/3,95 |
| ESR1 | rs3020434 | CC/CT/TT | 0,62/0,33/0,05 | 0,59/0,27/0,08 | 0,71/0,27/0,03 | 0,43/0,50/0,07 | 0,020/0,005 | 2,84/4,09 |
В случае 4 полиморфизмов rs3020434, rs11742635, rs2861221, rs17677069 у женщин с отягощенным анамнезом полностью отсутствует один из редких аллелей, гомозиготный вариант, что статистически отличает эту группу женщин от остальных. Данный факт может свидетельствовать о «протективной» роли редкого аллеля в патогенезе миомы матки, в частности для «семейных форм» данного заболевания. Однако более высокая частота обнаружения второго гомозиготного варианта аллелей данных полиморфизмов, наоборот, может свидетельствовать о роли частых вариантов полиморфизма в патогенезе миомы матки. Данное предположение может быть также подтверждено тем, что 2 полиморфизма из обнаруженных, а именно rs11742635 и rs17677069, являются сцепленными, т.е. располагаются в одном гене и могут быть прямо или опосредованно вовлечены в патологический процесс.
Обсуждение
Наличие «семейных» форм миомы матки у 5—10% женщин с данным заболеванием [7], высокий риск развития лейомиомы матки у родственников первой линии родства (риск выше в 2,5 раза) [8], более частая госпитализация монозиготных близнецов по поводу миомы матки по сравнению с дизиготными близнецами [9, 10] свидетельствуют о существенном вкладе генетического компонента в патогенез миомы матки.
Лейомиома матки является моноклональной опухолью [11—13], что предполагает развитие миоматозных узлов из одной клетки-предшественницы, поэтому внимание исследователей сосредоточено на изучении соматических мутаций в геноме миомы матки. Многочисленные молекулярно-биологические исследования выявили наиболее частый вариант соматических изменений генома в лейомиомах — мутации в гене MED12, встречающиеся в 70—80% миоматозных узлов [14—17]. Установлено, что подобные соматические мутации, обычно называемые «драйвер-мутациями», являются широко распространенным явлением в различных патогенных, в том числе онкогенных, процессах [18—22]. Тем не менее механизм, посредством которого конкретная соматическая мутация стимулирует развитие миомы матки, до сих пор не описан в деталях.
В исследовании, проведенном на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова», подтверждена роль соматических мутаций в гене MED12 в патогенезе миомы матки, в частности в развитии «семейных» форм данного заболевания. Кроме того, доказана моноклональная природа заболевания, так как в случаях множественной миомы матки в различных узлах, полученных от одной женщины, определялись разные мутации в гене MED12, однако причины и механизм возникновения этих мутаций остаются неизвестными [23].
В последние годы проведен ряд исследований, посвященных изучению генетических особенностей у женщин с лейомиомой матки. Большинство этих работ посвящены поиску однонуклеотидных полиморфизмов, которые могут быть связаны с генетической предрасположенностью к развитию данного заболевания. Общим осложнением, с которым сталкиваются ученые при поиске ассоциаций «генотип — фенотип» на основе GWAS для миомы матки, является то, что в большинстве этих исследований используют в качестве контрольных данные о женщинах, у которых нет лейомиомы. Однако заболеваемость миомой матки в популяции составляет около 70%, что свидетельствует о высокой вероятности выявления данного заболевания в будущем у большей части женщин контрольной группы. До настоящего времени не были предприняты попытки исследовать когорту пациенток без миомы матки (женщины в постменопаузе) по сравнению с когортой больных с семейной предрасположенностью к развитию данного заболевания, это произведено нами в данной работе.
Для достижения цели нашего исследования, заключающейся в поиске генетических маркеров риска развития лейомиомы матки, мы использовали GWAS-генотипирование женщин в постменопаузе без миомы матки и без семейной предрасположенности к данной патологии. Таким образом, предпринята первая попытка поиска «протективных» аллелей на основании нового подхода к набору когорты пациенток в группу контроля.
Заключение
В результате исследования идентифицированы шесть перспективных SNP, генотипирование которых впоследствии проведено на большой когорте пациенток с миомой матки. Полученные данные продемонстрировали однонаправленную тенденцию для всех SNP, а также значительное различие в аллельных и генотипических распределениях исследуемых однонуклеотидных полиморфизмов. Таким образом, мы обнаружили, что частоты минорных аллелей статистически значимо выше у женщин группы контроля и ниже у пациенток с миомой матки. Когорта пациенток с семейной предрасположенностью к миоме матки статистически отличалась от женщин группы контроля по четырем SNP (rs2861221, rs12457644, rs17677069, rs3020434, для всех тестов p>0,05). В случае rs12637801 наблюдалась статистически значимая разница между женщинами группы контроля и всеми пациентками с миомой матки (p=0,006), однако статистически значимых различий по сравнению с пациентками с миомой матки и отягощенным семейным анамнезом не было.
Полученные различия в частотах аллелей позволяют нам сделать вывод, что данные полиморфизмы могут использоваться в качестве маркеров для создания генетической панели оценки риска развития и прогнозирования рецидивирования миомы матки, которая может способствовать оптимизации диагностики, тактики ведения пациенток и прогнозирования риска рецидивирования данного заболевания, особенно в случаях «семейных форм» миомы матки.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Кузнецова М.В., Адамян Л.В.
Сбор и обработка материала — Согоян Н.С., Зеленский Д.В., Кузнецова М.В., Михайловская Г.В., Муллабаева С.М.
Статистический анализ данных — Шубина Е.С., Мишина Н.Д., Донников А.Е.
Написание текста — Согоян Н.С., Кузнецова М.В.
Редактирование — Адамян Л.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Работа выполнена в рамках государственного задания «Совершенствование тактики ведения больных доброкачественными заболеваниями органов репродуктивной системы с использованием высокотехнологичных методов функциональной визуальной диагностики и панели молекулярно-биологических маркеров прогрессирования и рецидива заболеваний».