Эндометриоз — гинекологическое заболевание, встречающееся преимущественно у женщин репродуктивного возраста и сопровождающееся дисменореей, диспареунией и хроническими тазовыми болями [1, 2], которые значительно ухудшают качество жизни. Распространенность эндометриоза трудно определить, так как заболевание может протекать бессимптомно, либо симптомы могут быть неверно интерпретированы, поэтому сообщается, что частота выявления эндометриоза составляет до 5—10% у менструирующих женщин и до 35% у женщин, страдающих бесплодием [2]. Кроме того, данные о распространенности эндометриоза широко варьируют вследствие отсутствия стандартизированных диагностических критериев [3].

Общеизвестным является тот факт, что патогенез, методы обследования и лечения при аденомиозе и наружном генитальном эндометриозе имеют свои особенности [4]. В связи с этим использование высокочувствительных и специфичных методов протеомики для диагностики эндометриоза различной локализации позволит полнее изучить патогенез заболеваний и в перспективе выявлять патологию на ранних стадиях.

В настоящее время создание неинвазивных диагностических тестов для подтверждения эндометриоза является основной задачей. Ведется поиск потенциальных биомаркеров путем протеомного профилирования образцов тканей эутопического и эктопического эндометрия, взятых у женщин с подтвержденным диагнозом эндометриоза [5]; активно изучается протеомный состав различных биологических жидкостей при эндометриозе [6]. Однако следует отметить, что исследования по поиску новых биомаркеров заболевания с использованием протеомных технологий не выходят за пределы экспериментальных исследований [7].

Цель исследования — изучить протеомный спектр плазмы крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ) у женщин с эндометриозом различной локализации.

Исследование выполнено в соответствии с разрешением локального этического комитета ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России (протокол № 71/2016 от 28.09.16).

В исследование включены 110 пациенток репродуктивного возраста. Диагноз «эндометриоз» подтверждали посредством ультразвукового исследования, магнитно-резонансной томографии, визуализации эндометриоидных поражений при проведении оперативного лечения с использованием лапароскопического или лапаротомного доступа и гистологической верификации диагноза после проведенной операции.

Все больные с эндометриозом разделены на группы: аденомиоз (ADN, n=27), эндометриоз яичников (ENM, n=30), перитонеальный эндометриоз (END, n=23), сочетание эндометриоза яичников и перитонеального эндометриоза (ENX, n=5).

Контрольную группу составили сопоставимые по возрасту пациентки без эндометриоза, которые оперированы с использованием лапароскопического доступа по поводу иной гинекологической патологии (фолликулярные кисты яичников, кисты желтого тела, серозоцеле, миома матки). Информированное согласие на участие в исследовании получено у всех исследуемых пациенток.

Забор крови из кубитальной вены в количестве около 6 мл осуществляли у женщин в день проведения оперативного лечения, замораживали и хранили при –80 °С. Перитонеальную жидкость отбирали из позадиматочного пространства во время проведения лапароскопии, подвергали центрифугированию при 1500 об/мин в течение 15 мин с целью осаждения клеточных элементов, замораживали при –80 °С и хранили до момента исследования.

Протеомный анализ ПК и ПЖ проведен у 11 пациенток (из общего числа пациенток указанных групп), из них 3 пациентки с аденомиозом, 2 — с эндометриозом яичников, 2 — с перитонеальным эндометриозом, 2 — с сочетанным поражением (эндометриозом яичников и перитонеальным эндометриозом); 2 пациентки представляли контрольную группу.

Пробоподготовка. Образцы плазмы (2 мкл) разбавляли до 20 мкл раствором 5 М мочевины, 7,5 мМ TCEP, 100 мМ TEABC и 1% дезоксихолата натрия. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 40 °C. Алкилирование проводили добавлением 2 мкл 2% раствора 4-винилпиридина в 30% изопропаноле. Реакционную смесь инкубировали в течение 20 мин при температуре окружающей среды в темноте. По окончании инкубации образцы разбавляли до 200 мкл 100 мM TEABC. К каждому образцу добавляли трипсин (10 мкл на образец, или 1 мкг). Протеолиз проводили при 37 °C в течение 3 ч с последующим дополнительным введением запасной аликвоты трипсина в количестве 500 нг (5 мкл на образец) в течение последующих 3 ч при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл 10% муравьиной кислоты. Образцы высушивали под вакуумом при 30 °C в течение 90 мин, затем осадки растворяли в 100 мкл 0,5% муравьиной кислоты для проведения жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией (LC-MS анализа).

Жидкостная хроматография. Пептиды разделяли с помощью жидкостной хроматографии на Ultimate 3000 RSLC Nano («Thermo Fisher Scientific», США) системе, оснащенной 5 мкл-петлей. Образцы все время хранили в термостате автосемплера при температуре 8±1 °С. Образцы отбирали со скоростью 12 мкл/мин и впрыскивали в петлю со скоростью 15 мкл/мин. Образцы загружали в обогащающую колонку Acclaim PepMap («Thermo Fisher Scientific», США) (5×0,3 мм, размер пор 300 Ǻ, размер частиц 5 мкм) в течение 4 мин при скорости потока 15 мкл/мин в подвижной фазе С (вода с 3,5% ацетонитрилом, 0,1% муравьиной кислотой и 0,05% уксусной кислотой, рН 2,75 при температуре 21 °C). Из обогащающей колонки пептиды вымывались и разделялись на аналитической колонке Acclaim PepMap (75 мкм×150 мм, размер частиц 1,8 мкм, размер пор 60 Ǻ) при скорости потока 0,30 мкл/мин в градиенте подвижной фазы, А (вода, рН 2,66 при температуре 20,8 °С) и подвижной фазы В (90% ацетонитрила и 10% метанола), обе — с 0,1% муравьиной кислотой и 0,03% уксусной кислотой. Для промывки колонки подвижной фазой В в течение 6 мин применялась динамическая скорость потока от 0,30 до 0,45 мкл/мин в пределах 1,25 мин.

Масс-спектрометрия. Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре высокого разрешения OrbitrapFusion («Thermo Fisher Scientific», США). Ионы-предшественники исследовали с разрешением R=60 K в диапазоне 425—1250 м/z. Ионы изолированы с помощью квадруполя с окном изоляции смещения ±1,0 Th и +0,25 Th и максимальным временем интеграции 15 мс, или AGC, установленным на 4e5 ионов. MS/MS для ионов-предшественников запускался на уровне 45% вершины хроматографического пика (заданное среднее значение FWHM составляло 24 s), если минимальное значение SNR составляло не менее 1500 отсчетов. Для тандемного сканирования запускались ионы с зарядовым состоянием Z=2+…7+. Фрагментированные ионы получены при энергии активации HCD, нормированной до 27%, и линейном изменении в пределах ±20%, а детектированы в сверхвысоком поле орбитального масс-анализатора с разрешением R-15K. Ионы накапливались в течение максимального времени интегрирования 47 мс или до установленного AGC значения 5e4 ионов. Активное динамическое исключение в течение 180 с при 6 повторах в течение 4 с регистрировалось для всех параллельных зарядовых состояний вводимых ионов-предшественников. Полное время рабочего цикла составляло 4 с, а отрезок В продолжался в диапазоне от 10 до 50 мин градиента элюирования.

Анализ данных. Исходные файлы данных поставщиков (raw-формат) преобразованы в подходящий для поиска mgf-формат с помощью программы MSConvert (ProteomeWizard). Данные найдены с помощью таксономической базы данных (Human, версия Uniprot), обогащенной ловушкой для обратных последовательностей. Предварительно установленные параметры поиска рассматривали трипсин как пищеварительный фермент с максимум двумя внутренними пропущенными расщеплениями. Разрешенные состояния заряда были от z=2+ до z=7+ с допуском прекурсора ±5 ppm и допуском фрагмент-ионов ±0,01 Da. Переменной модификацией, используемой для поиска и обнаружения, были дезамидирование Q/E, однократное окисление метионина и 4-гидроксипролин. Фиксированной модификацией было пиридилэтилирование 4-винилпиридином. Результаты извлечены не более чем на 1% от уровня FDR на основе суммарной частоты ложных открытий для PSM, пептидов и белков с динамической коррекцией результатов восстановленной последовательности с молекулярной массой последовательности канонического белка.

Все белки ПК и ПЖ, экспрессия которых изменялась при эндометриозе с различной локализацией эндометриоидных клеток по сравнению с контролем, представлены на рисунке,

При исследовании ПК выявлена группа белков, экспрессия которых оказалась пониженной только при аденомиозе (ADN): иммуноглобулин, тяжелая константная цепь γ 2 (значительно); α-дезинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми фрагментами 5, α-2-макроглобулин; афамин, сывороточная парооксоназа/арилэстераза 1. Одновременно отмечена группа белков, экспрессия которых повышалась только при аденомиозе: вариабельная цепь 3−21 иммуноглобулина λ, тяжелая константная цепь иммуноглобулина μ; α-1-антихимотрипсин; серотрансферрин и α-2-антиплазмин (табл. 2).

Для больных с эндометриомами (ENM) характерно значительное повышение содержания каппа вариабельной цепи иммуноглобулина в П.К. Кроме того, маркерами этого заболевания могут служить еще 2 белка: цитоскелетный кератин 1 тип II, содержание которого в ПК повышено при ENM и снижено при сочетанной локализации эндометриоза (ENX), а также аполипопротеин С1, содержание которого умеренно снижено как при ENM, так и при ENX (т.е. при заболевании, имеющем компоненту локализации ENM) (см. табл. 2).

Перитонеальный эндометриоз (END) характеризовался повышенной экспрессией аполипопротеина Е, С1s компонента комплемента, цитоплазматического актина 1, ингибитора плазменной протеазы С1, протромбина (содержание которого в крови повышено как при END, так и при сочетанной локализации эндометриоза — ENX). Но особенно значительным (в 7 раз по сравнению с контролем), хотя и неспецифичным для END, было повышение содержания фибронектина в ПК, что может являться важным диагностическим признаком. В то же время как при END, так и при ENX наблюдалось значительное снижение содержания плазменного обогащенного гистидином гликопротеина (см. табл. 2).

При сочетанном эндометриозе (эндометриомы и перитонеальный эндометриоз, группа ENX) в ПК наблюдались умеренное повышение содержания афамина и аполипопротеина А-II, J-цепи иммуноглобулина, α-2-SH-гликопротеина (сдвиг для этих белков специфичен), а также повышение содержания протромбина и β-цепи фибриногена, что может быть связано с наличием механизмов развития как ENM, так и END в патогенезе ENX. В то же время при ENX мы наблюдали умеренное и специфичное снижение содержания тяжелых цепей H2 и H4 ингибитора интер-α-трипсина, кератина 1 тип II с одновременным значительным неспецифичным снижением содержания гистидин-обогащенного гликопротеина и умеренным снижением содержания аполипопротеина С-1 (см. табл. 2).

При исследовании ПЖ нами обнаружено, что достаточно специфичным признаком для аденомиоза является повышение содержания одного белка — тяжелой константной цепи иммуноглобулина α1. Таким образом, ПЖ для диагностики аденомиоза менее информативна, чем П.К. Для ENM характерно схожее с эндометриозом сочетанной локализации (ENX) повышение содержания в ПЖ 3 белков: аполипопротеина А1, аполипопротеина, А IV и комплемента С3, которые могут рассматриваться в качестве претендентов на роль маркеров данного заболевания. Дифференциально-диагностическое значение для ENM может иметь еще один аполипопротеин, обнаруженный в ПЖ, — аполипопротеин В100, содержание которого при эндометриоме повышено, а при аденомиозе снижено.

Особенно значительно (хотя и неспецифично) при эндометриоме повышалось содержание ангиотензиногена (см. табл. 2). Следует отметить, что в ПК при данной патологии не наблюдалось изменений концентрации указанных белков по отношению к контролю. Вероятно, повышение содержания аполипопротеинов в ПЖ (апоЛП АI, апоЛП АIV, апоЛП В100) и комплемента С3, а также очень высокая экспрессия ангиотензиногена могут служить признаками поражения эндометриозом яичников, причем у пациенток не только группы ENM, но и группы ENX. С другой стороны, это может свидетельствовать о важности сосудистого и дисметаболического компонентов в патогенезе указанных видов патологии.

Исследованием также установлен характерный признак перитонеального эндометриоза (END) — специфическое снижение содержания в ПЖ 5 белков: легкой цепи каппа-иммуноглобулина, тяжелой цепи гамма 1- и 7-иммуноглобулина, фибриногена и антитромбина III. Относительное значение для дифференциальной диагностики END может иметь и α1-антихимотрипсин, содержание которого при данной патологии повышалось почти в 4 раза наряду с аналогичным повышением при ENХ (если есть компонента END) и более умеренным повышением при эндометриоме (ENM), но не при ADN.

При сочетанном эндометриозе яичников и перитонеальном эндометриозе (группа ENX) установлено специфическое понижение содержания в ПЖ 3 белков: альфа-1-субъединица кислого гликопротеина, сывороточного альбумина и инозитолполифосфат-1-фосфатазы. Интересно, что содержание кислого гликопротеина в ПК не имело дифференциально-диагностического значения, так как оказалось повышенным у женщин двух групп (ADN и ENX). Сывороточный альбумин в ПК также не имел диагностического значения, так как его содержание у пациенток всех исследуемых групп оставалось на уровне контроля, а инозитолполифосфат-1-фосфатаза в ПК не обнаружена. Таким образом, при сочетанной форме эндометриоза наиболее информативным (в контексте исследования трех указанных белков) является исследование ПЖ, но не ПК.

Вместе с тем при сочетанном эндометриозе в ПЖ обнаружена группа белков, содержание которых было повышено: альфа-1-антитрипсин, ингибитор плазменной протеазы С1, обогащенный гистидином гликопротеин, причем повышение их концентрации специфично и не наблюдалось даже у пациенток групп ENM и END. Специфическое повышение экспрессии у пациенток группы ENX отмечалось еще для 4 белков: иммуноглобулина λ константной цепи 7, иммуноглобулиновой тяжелой константы μ, β-цепи фибриногена и гистидин-обогащенного гликопротеина. У исследуемых других групп экспрессия этих белков снижалась, что придает этим различиям дифференциально-диагностическую ценность. Однако повышенная экспрессия большей части белков ПЖ у женщин группы ENX обусловлена все-таки составляющими ее компонентами молекулярного патогенеза ENM и END, на что указывают однонаправленные изменения их содержания (см. табл. 2). К таким белкам относились α-1-антихимотрипсин, тяжелая гамма 2 цепь иммуноглобулина, ингибитор интер-α-трипсина, комплемент С3, аполипопротеин А-I, аполипопротеин А-IV, кластерин. Заметим, что эти белки в ПК не обнаруживались.

С точки зрения доминирующего биологического назначения и функциональной активности целесообразно выделить пять групп белков, экспрессия которых отличалась от контроля: 1-я группа — белки острой фазы воспаления; 2-я группа — белки, участвующие в иммунном ответе (иммуноглобулины и система комплемента); 3-я группа — белки свертывающей системы; 4-я группа — участники транспорта липидов крови (липопротеины); 5-я группа — другие белки с разнообразными функциями, не вошедшие в предыдущие группы (табл. 3).

С учетом этой классификации можно сделать заключение о том, что все исследованные разновидности эндометриоза характеризуются выраженным дисбалансом белков, участвующих в иммунном ответе. Согласно данным литературы [3], в патогенезе генитального эндометриоза важная роль отводится нарушениям иммунной системы. Установлены выраженные нарушения системного и локального звеньев иммунитета у пациенток с указанной патологией.

Изменения фракций аполипопротеинов более характерны для ENM, причем это может свидетельствовать не только о дисметаболических нарушениях, но и косвенно подтверждать наличие воспаления и ассоциированного окислительного стресса [8].

Другими важными компонентами патогенеза всех видов исследуемой патологии являются нарушения в системе свертывания крови и системе фибринолиза, а также присутствие белков острой фазы воспаления (последнее наиболее очевидно у пациенток группы ENX). Это вполне соответствует известным данным о том, что экспрессия молекул с про- и антивоспалительной активностью, а также молекул, контролирующих реологические свойства крови, способствует адгезии фрагментов эндометриоидной ткани к поверхности брюшины, обеспечивает имплантацию клеток [9].

Особое место в функциональном отношении занимают белки 5-й группы. Из них маркером ADN является плазменный серотрансферрин (железосвязывающий белок), который наряду с С1s компонентом комплемента участвует в развитии иммунного ответа, что подтверждает гипотезу иммунного фактора бесплодия при эндометриозе [10], а также свидетельствует о важности транспорта и метаболизма железа (например, для синтеза гемопротеидов) в патогенезе этого заболевания. Другой белок — сывороточный альбумин — участвует в транспорте очень большого количества веществ, в том числе ионов меди и железа [11], что косвенно подтверждает предыдущее предположение.

Афамин (витамин Е-связывающий белок) известен как потенциальный биомаркер рака яичников, что подтверждено количественным иммуноанализом афамина в независимых когортах пациентов [12]. Следует отметить, что повышение экспрессии этого белка в ПК пациенток с сочетанным эндометриозом яичников и брюшины малого таза (группа ENM) позволяет предполагать высокую вероятность опухолевой трансформации при таком виде поражения (по сравнению, например, с аденомиозом, для которого характерно снижение экспрессии афамина в ПК). В пользу этого предположения свидетельствуют зарегистрированные нами изменения экспрессии кератина, который является в ряде случаев маркером опухолевой трансформации клеток [13].

Сывороточная параоксоназа/арилэстераза 1 — фермент, обладающий широкой специфичностью и каталитической универсальностью. Основной функцией являются предотвращение окисления липопротеинов и уменьшение образования липидных пероксидов [14]. Его сниженная экспрессия в ПК при аденомиозе может свидетельствовать о наличии выраженного окислительного стресса при этом заболевании.

Обогащенный гистидином гликопротеин, взаимодействуя с тромбоспондином, ингибирует фибринолиз, оказывает потенциальное протромботическое влияние, участвует в клиренсе апоптотических фагоцитов, иммунных комплексов, адгезии клеток и ангиогенеза [15]. Помимо гепатоцитов, его продуцентами являются клетки периферической крови, что характерно, например, для участков неоангиогенеза. Обогащенный гистидином гликопротеин может взаимодействовать с CD36 (рецептор тромбоспондинов 1 и 2), фактически конкурируя за один сайт связывания, тем самым стимулируя процессы ангиогенеза и способствуя миграции эндотелиальных клеток при формировании новых сосудов [16]. Таким образом, логичным является повышение экспрессии этого белка только в ПЖ при ENX, где, вероятнее всего, реализуется его ключевая роль как конкурента тромбоспондинов в регуляции локального ангиогенеза. Вместе с тем существуют и данные о проявлении этим белком антиангиогенной активности [17], что, несомненно, требует дальнейшего изучения.

С тромбоспондинами связан и другой мультидоменный белок — α-дизентегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновыми мотивами-5 (ADAMTS-5) из семейства внеклеточных протеиназ, концентрация которого в ПК оказалась сниженной при ADN. ADAMTS-5 вовлечен в ремоделирование внеклеточного матрикса эндометрия, находясь под регуляторным влиянием эстрадиола, прогестерона [18], его тромбоспондиновые фрагменты в структуре молекулы важны для протеолиза субстрата и связывания с рецептором CD36, например на клетках эндотелия сосудов [19, 20]. Таким образом, предположенная ранее роль ADAMTS-5 в патогенезе эндометриоза [21] весьма вероятна, однако остается вопрос, почему в отличие от обогащенного гистидином белка изменения концентрации ADAMTS-5 оказались выраженными только при ADN, но не при ENX.

В результате проведенного исследования плазмы крови и перитонеальной жидкости методами протеомики определены уникальные белки, проявляющие различную экспрессию в зависимости от локализации эндометриоза. Результаты исследования в совокупности с клиническими данными могут быть использованы для дифференциальной диагностики эндометриоза различной локализации.

Финансирование. Грант УМНИК Фонда содействия инновациям от 03.07.17. (Договор № 11812ГУ/2017).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Сазонова Н.Г. — аспирант кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; e-mail: sazonovang@list.ru; eLibrary SPIN: 8946-3440; https://orcid.org/0000-0002-5219-6450

Кутяков В.А.— к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; https://orcid.org/0000-0001-7814-4176

Оловянникова Р.Я. — к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; eLibrary SPIN: 9147-3878; https://orcid.org/0000-0002-7902-7876

Копылов А.Т. — к.б.н., лаборатория системной биологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» Минобрнауки России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-7199-372х

Тохидпур А. — к.б.н., доцент кафедры оперативной гинекологии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; https://orcid.org/0000-0002-8216-3393

Макаренко Т.А. — д.м.н., НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; https://orcid.org/0000-0001-7823-6222

Салмина А.Б. — д.м.н. профессор кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ФГБУО ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, Красноярск, Россия; eLibrary SPIN: 6504-7657; https://orcid.org/0000-0003-4012-6348

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Сазонова Н.Г., Кутяков В.А., Оловянникова Р.Я., Копылов А.Т., Тохидпур А., Макаренко Т.А., Салмина А.Б. Особенности протеома периферической крови и перитонеальной жидкости у больных эндометриозом различной локализации. Проблемы репродукции. 2019;25(6):95-104. https://doi.org/10.1716/repro20192506195

Автор, ответственный за переписку: Сазонова Н.Г. —
e-mail: sazonovang@list.ru