Медленное замораживание и витрификация эмбрионов. Сравнение эффективности

В настоящее время применение современных технологий криоконсервации позволяет сохранить эмбрионы хорошего качества, не использованные для нативного переноса в циклах ЭКО. Это дает возможность при проведении последующих переносов эмбрионов обходиться без стимуляции яичников и пункции фолликулов, что устраняет риск связанных с ними осложнений, увеличивает кумулятивную частоту наступления беременности и снижает экономические затраты. К тому же отсроченный перенос свежеполученных эмбрионов позволяет продолжить попытку преодоления бесплодия в ситуациях, когда текущий стимулированный цикл ЭКО приходится прерывать на дотрансферном этапе, например при признаках развития тяжелого синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ).

Сегодня для криоконсервации эмбрионов используют две технологии — медленного замораживания (МЗ) и витрификации [1—3]. Оба метода с момента внедрения в клиническую практику прошли множество модификаций для повышения их эффективности, оцениваемой по влиянию на выживаемость размораживаемых эмбрионов и на их способность к имплантации при последующем переносе в полость матки, и к настоящему времени прочно утвердились в арсенале средств вспомогательной репродукции. Очевидно, однако, что существование двух методов, используемых с абсолютно одинаковыми целями в одних и тех же клинических ситуациях, неизбежно порождает вопрос о предпочтительности выбора того или иного из них. Многие специалисты указывают на увеличение частоты наступления беременности в криопротоколах программ ЭКО при использовании для их сохранения витрификации вместо МЗ [4—8], однако не меньшее число авторов настаивают на сопоставимости результатов, получаемых с помощью этих методов [9—11]. Вероятной причиной расхождений в оценке результатов, получаемых при использовании двух описываемых конкурирующих криотехнологий, может быть недостаточный учет факторов, способных влиять на их эффективность. К таковым следует отнести, прежде всего, возраст пациенток, а также стадию развития эмбрионов в момент их замораживания. С учетом этого обстоятельства мы провели собственное исследование с целью сравнительной оценки эффективности методов витрификации и МЗ, оцениваемой по их влиянию на выживаемость размораживаемых эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития, и на частоту наступления беременности при их отсроченном переносе в программах ЭКО у пациенток разных возрастных групп.

За период с мая 2012 г. по декабрь 2013 г. было выполнено 815 циклов замораживания/размораживания эмбрионов у 675 пациенток в возрасте 23—42 лет с формами бесплодия, обусловливавшими показания к ЭКО. Перенос выживших размороженных криоэмбрионов был произведен в 731 (89,7%) цикле, тогда как в остальных 84 (10,3%) циклах его не выполняли из-за отсутствия после размораживания жизнеспособных эмбрионов.

Криоконсервационные технологии, обеспечивавшие возможность применения размораживаемых эмбрионов в отсроченных нестимулированных циклах ЭКО, в настоящем исследовании использовали для сохранения:

— либо «лишних» эмбрионов, остающихся после переноса части свежеполученных эмбрионов в текущем стимулированном цикле ЭКО, не сопровождавшемся возникновением беременности, — в 588 (72,1%) циклах;

— либо всех свежеполученных эмбрионов при невозможности их переноса в текущем стимулированном цикле ЭКО по разным причинам (при угрозе СГЯ, неподготовленности эндометрия, признаках преждевременной лютеинизации, острых сопутствующих инфекционных заболеваниях, не связанном с медицинскими показаниями желанием пациентки и т. д.) — в 227 (27,9%) циклах.

Для криоконсервации эмбрионов применяли:

— метод МЗ с использованием сред Origio (Medicult) на программируемых фризерах Cryologic в соломинах закрытой системы — в 670 (82,2%) циклах;

— метод витрификации на средах и носителях «открытой» (контактирующей с азотом) системы фирмы «Cryotech» — в 145 (17,8%) циклах.

Замораживание и размораживание эмбрионов с использованием технологий МЗ или витрификации выполняли по стандартным протоколам [3, 12]. Размороженные эмбрионы находились в среде Сook, подбираемой с учетом стадии эмбрионального развития (cleavage или blastocystmedium), и культивировали в СО2-инкубаторе до момента их переноса в полость матки.

Отсроченный (через 2—18 мес после выполнения криоконсервации) перенос размороженных эмбрионов (ПЭ) выполняли в нестимулированных циклах с подготовительной гормональной терапией (ПГТ). Для ПГТ использовали препараты эстрогенов (Прогинова, Эстрофем или Дивигель) в суточной дозе от 4 до 16 мг со 2—5-го дня цикла в течение 12—14 дней. При достижении эндометрием толщины 8 мм и более по данным ультразвукового исследования (УЗИ) к терапии эстрогенами дополнительно подключали препараты прогестерона (Утрожестан по 200 мг 3 раза в день интравагинально, прогестерон или Крайнон 1 аппликатор 1 раз в день интравагинально). ПЭ проводили на 4—6-й день после назначения препаратов прогестерона.

Качество переносимых 3-дневных эмбрионов оценивали по J. Lens и соавт. [13], 5-дневных бластоцист — по D. Gardner и соавт. [14]. Переносили не более 2 эмбрионов при условии их хорошего качества и при возрасте пациенток не старше 40 лет — в 615 (84,1%) циклах. У женщин старше 40 лет и/или при выявляемых качественных недостатках всей группы размороженных эмбрионов переносили более 2 эмбрионов (в ситуациях, когда число выживших после размораживания эмбрионов позволяло это сделать) — в 44 (6%) циклах. Перенос одного эмбриона был выполнен в 72 (9,8%) циклах, причем во всех случаях он был вынужденным (неселективным) из-за наличия после размораживания лишь единственного выжившего эмбриона. Перенос одного селективного эмбриона в данной работе мы не практиковали.

После ПЭ пациенткам продолжали назначенную поддерживающую терапию препаратами прогестерона до момента подтверждения/исключения беременности по уровню ß-чХГ на 14-й день после П.Э. При констатации биохимической беременности использование всех препаратов продолжали до момента ультразвукового (УЗ) подтверждения беременности (21—28-й день после ПЭ). При УЗ-подтверждении клинической беременности вопрос о продолжении поддерживающей терапии решался в зависимости от клинической ситуации в соответствии с существующими клиническими рекомендациями [15].

При оценке результатов в настоящей работе предусматривалось уточнение частоты случаев отмены ПЭ из-за отсутствия выживших после размораживания эмбрионов в группах больных, у которых для криоконсервации применяли методы МЗ и витрификации. В этих же группах анализировали влияние на частоту выживаемости размораживаемых криоэмбрионов и на частоту наступления беременности следующих факторов:

— возраста пациенток (≤35, 36—39, ≥40 лет);

— стадии развития эмбриона в момент замораживания (3-й или 5-й день культивирования invitro, т. е. эмбрионы на стадии 6—8 бластомеров или на стадии бластоцисты). Культивирование производилось в одинаковых условиях в средах СООК.

Полученные результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 6,0. Статистически достоверными считались различия между сопоставляемыми группами количественных показателей при уровне значимости р<0,05.

При уточнении инцидентности случаев отмены ПЭ (из-за отсутствия выживших после размораживания эмбрионов) было установлено, что их частота составила (табл. 1):

— при применении метода МЗ — 11,7% (79 случаев на 670 циклов);

— при применении витрификации — 3,4% (5 случаев на 145 циклов).

При этом доля жизнеспособных эмбрионов среди всех размороженных эмбрионов после витрификации достигала 97,7% (1015 из 1039), тогда как после МЗ она была заметно меньшей — 88,6% (4111 из 4642).

Статистическая обработка этих данных показала, что сопоставлявшиеся группы достоверно различались между собой как по частоте отмены ПЭ (р=0,001), так и по доле выживших эмбрионов (р<0,001), что указывает на безусловное преимущество метода витрификации над технологией МЗ по критерию обеспечения жизнеспособности размораживаемых эмбрионов и, как следствие, созданию условий для выполнения ПЭ.

Следующим этапом нашего исследования стала оценка зависимости выживаемости эмбрионов от метода их замораживания (витрификации или МЗ), возраста пациенток (≤35, 36—39, ≥40 лет) и стадии развития эмбрионов в момент их замораживания (стадия 6—8 бластомеров или бластоцисты). Полученные при этом результаты позволяют отметить, что у женщин, у которых замораживание эмбрионов выполняли на стадии 6—8 бластомеров, применение витрификации вместо МЗ обеспечивало достоверное увеличение (на 7—11%) доли выживших эмбрионов в каждой возрастной группе (табл. 2). Среди пациенток, у которых криоконсервации подвергались бластоцисты, использование витрификации вместо МЗ обеспечивало достоверное возрастание выживаемости размораживаемых эмбрионов лишь у пациенток не старше 35 лет, тогда как у более возрастных пациенток описываемая закономерность носила лишь характер тенденции (табл. 3).

Вполне очевидно, что отмечавшееся уменьшение доли выживших эмбрионов в старших возрастных группах связано с возрастным снижением способности размораживаемых эмбрионов восстанавливать свой гомеостаз. Однако из полученных нами результатов следует, что даже на фоне усиливающегося негативного влияния возраста больных на резистентность эмбрионов к криотравме, использование метода витрификации вместо МЗ способно в определенной мере ослаблять это явление. Последнее проявляется в большем проценте выживаемости размораживаемых криоэмбрионов при применении для их консервации витрификации вместо МЗ у пациенток старше 35 и 40 лет.

Представленные данные приводят к очевидному выводу о том, что выбор витрификации вместо МЗ обеспечивает лучшую выживаемость размораживаемых криоэмбрионов, в особенности при их замораживании на стадии 6—8 бластомеров, что вполне согласуется с сообщениями других специалистов [4—8]. Данная закономерность по нашим наблюдениям не находила статистического подтверждения лишь при замораживании эмбрионов на стадии бластоцисты у пациенток старше 35 лет, хотя и у этих пациенток прослеживалась явная тенденция к улучшению результатов при применении именно метода витрификации.

Анализ показателя частоты наступления беременности в расчете на ПЭ (ЧНБПЭ) в группах, где выполнялся перенос 3-дневных эмбрионов (табл. 4) и бластоцист (табл. 5), выявил две закономерности.

Во-первых, в сравнении с методом МЗ эмбрионов применение для той же цели витрификации обеспечивало большую ЧНБПЭ во всех возрастных группах. Это положение не удалось подтвердить лишь для пациенток старше 40 лет, у которых выполнялся перенос размороженных бластоцист, криоконсервированных путем витрификации, что было связано с недостаточным (всего лишь два) количеством наблюдений.

Во-вторых, полученные результаты показывают, что увеличение возраста больных сопровождается ослаблением эффекта повышения показателя ЧНБПЭ при замене метода МЗ на витрификацию на фоне возрастного уменьшения вероятности успешной имплантации переносимых эмбрионов. Здесь надо отметить, что поздний репродуктивный возраст снижает возможность эффективной нидации даже свежеполученных эмбрионов [16—18]. В свою очередь из-за возрастного снижения имплантационного потенциала эмбрионов появляются трудности при оценке преимуществ тех или иных методов криоконсервации в случаях, если критерием их эффективности у женщин позднего репродуктивного возраста выбирается показатель ЧНБПЭ. Очевидно, что именно по этой причине обнаруживаемая нами разница значений показателя ЧНБПЭ при использовании разных методов криоконсервации у пациенток старше 35 лет не носила достоверного характера (р>0,05), хотя в процентном выражении все же указывала на бо́льшую эффективность именно метода витрификации.

Как можно видеть из представленных данных, проведенная оценка зависимости показателя ЧНБПЭ от метода криоконсервации эмбрионов наглядно продемонстрировала преимущество технологии витрификации над методом МЗ, в особенности при использовании криоэмбрионов у пациенток относительно молодого (≤35 лет) возраста.

Собранный нами фактический материал показывает, что при применении витрификации вместо МЗ удается уменьшить частоту отмены ПЭ из-за отсутствия выживших размороженных эмбрионов и одновременно обеспечить получение большего количества жизнеспособных эмбрионов, причем независимо от стадии их развития в момент криоконсервации и возраста пациенток. Очевидно, что бо́льшая выживаемость криоэмбрионов обеспечивает более благоприятные условия для их селекции. В свою очередь возможность выбора для переноса в матку более качественных эмбрионов служит повышению вероятности их последующей успешной имплантации, что собственно и подтверждается при оценке зависимости показателя ЧНБПЭ от использованной технологии криоконсервации переносимых размороженных эмбрионов.

Приходится, однако, констатировать, что при выполнении ЭКО с криоэмбрионами у женщин позднего репродуктивного возраста использование витрификации вместо МЗ неспособно компенсировать возрастное снижение способности эмбрионов к имплантации. Примечательно, что у пациенток старше 40 лет, хотя и имеет место некоторое уменьшение частоты выживания размораживаемых эмбрионов, однако этот показатель остается еще достаточно высоким (80—95%), что почти всегда позволяет иметь достаточное количество выживших эмбрионов для переноса. Тем не менее, несмотря на нередкий перенос более 2 эмбрионов, отобранных как лучшие из имеющихся, нам все же не удалось обеспечить сохранение показателя ЧНБПЭ у пациенток старшего возраста на уровне, регистрируемом у более молодых пациенток. Это наблюдение указывает на то, что у женщин позднего репродуктивного возраста и, казалось бы, «качественные» эмбрионы последние отнюдь не всегда являются таковыми, поскольку многие из них вероятно содержат скрытые дефекты, мешающие их успешной имплантации. Из этого следует, что в позднем репродуктивном возрасте ухудшение показателя ЧНБПЭ в программах ЭКО с криоэмбрионами связано отнюдь не с драматическим снижением частоты выживаемости размораживаемых эмбрионов, а с негативным влиянием возрастного фактора на способность эмбрионов к имплантации. Данное положение доказывается фактом снижения у пациенток старше 40 лет частоты имплантации не только размороженных, но и свежеполученных эмбрионов [16—18].

Заслуживает внимания, что предпочтительность использования витрификации вместо медленного замораживания для криоконсервации эмбрионов аргументируется не только показателями эффективности, отражающими процент выживаемости размораживаемых криоэмбрионов и ЧНБ при их переносе, но и чисто экономическими соображениями. Как справедливо отмечают многие специалисты [9, 19] и свидетельствует наш опыт, в сравнении с методом МЗ при витрификации эмбрионов:

— расходуется меньше жидкого азота;

— требуется меньшее количество дорогостоящего оборудования;

— сокращается время на выполнение необходимых лабораторных манипуляций и облегчается их проведение в оптимальные сроки, учитывающие индивидуальное развитие эмбрионов, планируемых к криоконсервации.

Таким образом, проведенное собственное исследование и сообщения других специалистов позволяют заключить, что для криоконсервации эмбрионов на стадии 6—8 бластомеров или бластоцисты представляется оправданным отказ от метода МЗ в пользу витрификации. Это заключение обосновывается как соответствующими клиническими наблюдениями, характеризующими выживаемость размораживаемых эмбрионов и их способность к имплантации у пациенток разного возраста, так и экономическими расчетами, учитывающими затратность лабораторных манипуляций при применении двух сравниваемых конкурирующих криотехнологий.