Стремительное развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) на сегодняшний день позволяет использовать ооциты донора в различных программах ЭКО/ИКСИ для лечения пациенток с недостаточностью функции яичников и даже отсутствием яичников. Первая беременность с использованием ооцитов донора у женщин без яичников была получена в 1984 г. P. Lujiet и соавт. [21]. В России этот метод лечения бесплодия начали применять с 90-х годов XX века. Согласно приказу № 107 Министерства здравоохранения РФ от 30.08.12, донорами ооцитов имеют право быть женщины в возрасте от 18 до 35 лет, физически и психически здоровые, прошедшие медико-генетическое обследование. В России разрешено как анонимное, так и не анонимное донорство. Потребность в проведении программы донорства ооцитов (ДО) составляет 20—25% среди всех пациенток, обращающихся по поводу лечения бесплодия, что обусловлено наличием среди них значительной доли женщин старшего репродуктивного возраста [21]. Показаниями для использования ооцитов донора в программах ВРТ являются: а) отсутствие ооцитов, обусловленное естественной менопаузой, синдромом преждевременного истощения яичников, синдромом резистентных яичников, состоянием после овариэктомии, радио- или химиотерапии, генетическими заболеваниями; б) неудачные повторные попытки (3 и более) проведения программы ЭКО/ИКСИ при недостаточном ответе яичников на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС), неоднократном получении эмбрионов низкого качества, перенос которых не приводит к наступлению беременности, снижение овариального резерва. Следует отметить, что наличие большого разнообразия лекарственных препаратов с различным составом гормонов: рекомбинантного (р) ФСГ, ЛГ, ЧМГ (человеческий менопаузальный гормон), содержащего как ФСГ, так и ЛГ [6, 20] обусловило необходимость дифференцированного подбора протоколов КОС в программе Д.О. Для обеспечения безопасности проводимых программ при выборе протокола КОС следует учитывать состояние репродуктивной системы донора ооцитов для получения оптимальных результатов лечения и предотвращения осложнений [8, 17, 18, 20]. Согласно отчету Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ), частота наступления беременности в программе ДО составила в расчете на перенос эмбриона 44,3% в 2010 г. (в 2009 г. — 45,8%). Причиной более высокой эффективности программ донорства ооцитов является то, что ооциты донора получают от молодых женщин с отсутствием какой-либо патологии, способной оказывать негативное влияние на качество гамет. Данный факт доказывает, что для успеха ЭКО/ИКСИ имеет значение именно качество используемых ооцитов, а не соматический и гинекологический статус пациенток. Не следует забывать и об осложнениях программ КОС-ДО. M. Sauer [12] в 2010 г. в своей научной работе — обзор осложнений у доноров ооцитов отмечает в серии из 1000 пункций ооцитов у 7 (0,7%) доноров были осложнения, потребовавшие госпитализации. В их число вошли 3 донора с тяжелым синдромом гиперстимуляции яичников (СГЯ), 2 — с побочными реакциями на анестезию, 1 — с внутрибрюшным кровотечением после аспирации и 1 пациентка с атонией мочевого пузыря и гематурией после аспирации. Совершенствование технологий криоконсервации — применение метода витрификации способствует увеличению использования программ Д.О. Выживаемость ооцитов после витрификации и их способность к оплодотворению после размораживания составляет в последние годы 90—95% [4]. Таким образом, учитывая актуальность программы ДО, задача выбора наиболее рационального протокола КОС, который обеспечивает максимальную эффективность и имеет, возможно, минимальный риск развития осложнений, занимает существенное место в общей стратегии программ ВРТ.

Цель исследования — сравнить три протокола КОС, использованные у доноров ооцитов: длинный протокол с а-ГнРГ, протокол с ант-ГнРГ, модифицированный протокол с использованием антиэстрогена — Клостилбегит + рФСГ, а также провести оценку выживаемости ооцитов после витрификации в зависимости от применяемого протокола КОС.

В настоящем исследовании проанализировано 270 протоколов контролируемой овариальной стимуляции у 121 донора ооцитов. Исследование проводили на базе Российско-Финской клиники «АВА-ПЕТЕР» в период с 2009 по 2013 г. Доноры ооцитов разделены на три группы, в зависимости от применяемого протокола КОС. Перед каждым протоколом КОС донорам ооцитов проводили оценку овариального резерва (подсчет числа антральных фолликулов с помощью ультразвукового исследования (УЗИ) малого таза, оценку антимюллерова гормона — уровня АМГ).

В 1-ю группу включено 70 протоколов КОС-ДО с использованием длинного протокола с а-ГнРГ. Доноры ооцитов данной группы проходили этап десенситизации гипоталамо-гипофизарной системы препаратами а-ГнРГ с 21-го дня предыдущего менструального цикла. При достижении десенситизации аденогипофиза (2—3-й день менструального цикла) начинали стимуляцию препаратами гонадотропинов с помощью рФСГ.

Во 2-ю группу включен 151 протокол с применением протокола с ант-ГнРГ. КОС начинали со 2—3-го дня менструального цикла гонадотропинами — рФСГ. При достижении лидирующим фолликулом диаметра около 14 мм назначали ежедневное введение ант-ГнРГ.

В 3-ю группу включено 49 протоколов КОС-ДО с применением модифицированного протокола КОС с клостилбегитом («Egis Pharmaceuticals, Plc», Венгрия) и рФСГ. С 1—3-го дня менструального цикла донорам вводили рФСГ, с 6-го дня менструального цикла при достижении фолликулами диаметра около 12—13 мм назначали Клостилбегит. Далее, при достижении фолликулами диаметра 18 мм, по данным УЗИ, во всех трех группах донорам вводили триггер овуляции рчХГ или а-ГнРГ. Через 36 ч производили пункцию фолликулов под контролем ультразвукового мониторинга.

Оценку полученных ооцитов проводили через 2 ч после пункции фолликулов. Для этого ооцит-кумулюсные комплексы методом пипетирования в растворе  гиалуронидазы  (80 МЕ) в течение 30 с очищали от кумулюса, промывали  в культуральной среде и оценивали с помощью инвертированного микроскопа (рис. 1), а также на аппарате Oocyte (рис. 2). Зрелые ооциты, находящиеся на МII деления, — клетки, в которых завершилось первое деление мейоза (в результате — отделение первого полярного тельца), диаметр их составляет 110—120 мкм, они окружены равномерной блестящей оболочкой (zona pellucida), цитоплазма  без вакуолей и дополнительных включений  (некротические или вакуоли).

Яйцеклетки, находящиеся на стадии МII деления (см. рис. 1), подвергали витрификации, данный метод криоконсервации привлекает все большее внимание исследователей разных стран [5, 7, 10, 12, 15, 16]. Большинство полученных данных свидетельствует о преимуществах витрификации [3, 8, 14]. Витрификацию осуществляли с использованием набора для витрификации Kitazato Cryotop Kit Vitrification VT401. В дальнейшем, по необходимости применения ооцитов в программе ДО, их размораживали. Оплодотворение выживших ооцитов производили в 100% случаев с помощью ИКСИ. Для оценки эмбрионов использовали шкалу Гарднера. Перенос эмбрионов реципиенту производили на 3-й или 5-й день развития. Факт наступления беременности определяли с помощью биохимического теста (уровень β-чХГ) и по данным УЗИ при наличии в полости матки плодного яйца.

При включении в программу донор получал полную информацию об использовании ооцитов и возможных осложнениях. Обязательным являлось добровольное согласие всех участвующих в программе субъектов и оформление соответствующих нормативных документов. Полученные в процессе исследования клинические результаты анализировали c использованием системы Statistica for Windows (версия 5.5 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). Сопоставление частотных характеристик качественных показателей (препараты, характеристики бесплодия, исходы) проводилось с помощью непараметрических методов χ², χ² с поправкой Йетса (для малых групп), χ² Пирсона, одно- и двустороннего критерия Фишера. Сравнение количественных параметров (возраст доноров и реципиентов, длительность витрификации, характеристики видов ооцитов и т. п.) в исследуемых группах осуществлялось с использованием критериев Манна—Уитни, медианного χ² и модуля ANOVA [22, 23]. Критерием статистической достоверности получаемых выводов мы считали общепринятую в медицине величину р<0,05. При этом устойчивый вывод о наличии или отсутствии достоверных изменений нами формулировался тогда, когда мы имели идентичные по сути результаты по всему набору применявшихся критериев.

Как видно из табл. 1, в исследуемых группах нет статистически достоверных различий по возрасту пациенток и длительности КОС (p>0,05). При оценке у доноров ооцитов овариального резерва, которую проводили перед каждым протоколом контролируемой овариальной стимуляции (табл. 2), статистически значимых различий по анализируемым параметрам в трех исследуемых группах выявлено не было (p>0,05). Несмотря на то что существенных различий в овариальном резерве у доноров ооцитов выявлено не было, средняя суммарная дозировка рФСГ на один протокол КОС достоверно (p<0,05) больше в 1-й группе с использованием длинного протокола с а-ГнРГ по сравнению с другими исследуемыми группами.

Таким образом, после фазы десенситизации донорам ооцитов необходима большая суммарная дозировка гонадотропинов для получения адекватного ответа на протокол КОС. Так как целью КОС-ДО является получение наибольшего количества зрелых ооцитов, находящихся на MII деления, пригодных для использования в дальнейшем в программах ЭКО/ИКСИ, следующим этапом нашего исследования явился анализ и оценка различных параметров полученных ооцитов (табл. 3).

Как видно из табл. 3, в среднем за один протокол КОС-ДО наибольшее количество ооцитов получено во 2-й группе, но при этом количество ооцитов хорошего качества, находящихся на МII деления, которые были криоконсервированы с помощью метода витрификации, получено достоверно больше в 3-й группе (p<0,05). В последующем при необходимости использования в протоколах ЭКО/ИКСИ витрифицированных донорских ооцитов на одну программу мы размораживали ооцитов в среднем в 1-й группе 10,5±0,5, во 2-й группе — 11,2±0,3, в 3-й группе — 12,9±0,6. Количество выживших ооцитов после размораживания для протоколов ЭКО/ИКСИ достоверно различалось в группе с применением модифицированного протокола (рФСГ+КБ) по сравнению с 1-й и 2-й группами (р<0,05) (см. табл. 3, рис. 3), данные показатели отличаются от результатов исследования, приведенных в современных зарубежных источниках литературы [4, 10]. Выживаемость ооцитов в исследуемых группах в свою очередь составляла 87±15, 84±17, 88±15% соответственно. Мы также обратили внимание на количество незрелых ооцитов, полученных в каждом протоколе КОС-ДО, в 1-й группе получено достоверно наименьшее количество GV ооцитов (p<0,05). Количество полученных атретичных ооцитов достоверно различалось только при сравнении 1-й группы с 3-й, т. е. в 3-й группе их количество достоверно было больше (p<0,05). Внешняя оболочка — zona pellucida без ооцита получена при использовании разных протоколов КОС-ДО, и количество случаев ее получения достоверно различается при сравнении трех групп (р<0,05): 0,3±0,6, 0,9±1,4, 0,9±1,1 соответственно. Наибольшее количество ооцитов низкого качества, которые были исключены в дальнейшем из программы ЭКО/ИКСИ, получены в 3-й группе (см. табл. 3), а показатели как в количественном, так и в процентном соотношении достоверно различаются при сравнении 1-й группы с 3-й и 2-й группы с 3-й (p<0,05).

При анализе заключительного этапа КОС-ДО, т. е. применении различных лекарственных препаратов в виде триггера овуляции (табл. 4), получены следующие данные: а-ГнРГ мы применяли в качестве триггера овуляции со следующей частотой: в 1-й группе — 0%, во 2-й группе — 35%, в 3-й группе — 84%, а рчХГ использовали: в 1-й группе — 100%, во 2-й группе — 64%, в 3-й группе — 16%. При этом следует обратить внимание на то, что при использовании а-ГнРГ в виде триггера получено достоверно большее количество ооцитов хорошего качества, находящихся на стадии МII деления, — 17±8 (p<0,05). В зарубежных научных исследованиях также все больше внимания уделяется использованию а-ГнРГ в качестве триггера овуляции. Так, S. Kol и соавт. [9] указывают на эффективность, безопасность и удобство применения а-ГнРГ в виде триггера. J. Awwad и соавт. [1] при обследовании группы пациенток с повышенным риском развития СГЯ, у которых применялся а-ГнРГ в качестве триггера, не отметили ни одного случая развития СГЯ. A. Sismanoglu и соавт. [13] в 2009 г. указали в своей научной работе на то, что в программах ДО применение а-ГнРГ как триггера овуляции практически исключает развитие СГЯ, отмечено удобство применения для пациентов, высокий процент зрелых ооцитов, частота наступления беременности у реципиентов составила 40,2%.

В последующем ооциты донора размораживали, проводили ИКСИ и перенос эмбрионов осуществляли на 3-й или 5-й день развития реципиентам. Реципиенты в исследуемых группах статистически значимо не различались (p>0,05) по возрасту (40,6±0,5 года), индексу массы тела, длительности и причине бесплодия. Частота наступления беременности в трех исследуемых группах составляла: 55,2, 44,1, 55,8% соответственно, достоверных различий по данному показателю не выявлено (р>0,05). Осложнения программ ВРТ в виде СГЯ 2—3-й степени наблюдались во 2-й группе — 1 случай СГЯ 2-й степени и 1 случай СГЯ 3-й степени, в 3-й группе — 1 случай СГЯ 2-й степени.

По результатам нашего исследования, в длинных протоколах с применением а-ГнРГ донорам ооцитов необходима большая суммарная дозировка рФСГ в программах КОС-ДО. Общее количество полученных ооцитов в трех исследуемых группах достоверно не различалось, а количество зрелых ооцитов, находящихся на МII деления, которые подвергли криоконсервации методом витрификации, достоверно больше в 3-й группе (p<0,05). В исследовании, проведенном Murber и соавт. в 2009 г., результаты сравнения эффективности протоколов с использованием ант-ГнРГ и а-ГнРГ несколько отличаются от полученных нами. Так, в группе с применением ант-ГнРГ количество аспирированных фолликулов и полученных ооцитов было достоверно ниже по сравнению с группой, где применялись а-ГнРГ. Наибольший процент некачественных ооцитов, исключенных из программ ЭКО/ИКСИ, в нашей научной работе получен в 3-й группе, а наименьший — в 1-й группе.

Идеального протокола КОС не существует. Подбор протокола следует проводить в зависимости от показателей овариального резерва. По результатам настоящего исследования оптимальным для донорства ооцитов является модифицированный протокол, при котором получено достоверно наибольшее количество зрелых яйцеклеток.

Замена триггера овуляции на а-ГнРГ в протоколах стимуляции позволяет получить достаточное количество зрелых ооцитов, а также снизить риск осложнений в виде СГЯ, и может быть рекомендована у доноров ооцитов.

Важной частью современной программы ДО должен стать метод витрификации, который показал нам достаточно высокие результаты выживаемости ооцитов вне зависимости от применяемого метода КОС-ДО. Эти преимущества позволят, по-видимому, в ближайшее время заменить все другие методы криоконсервации в программах ВРТ, применять витрификацию и в программах ДО с целью получения наилучших результатов.